El DNA para diagnóstico de enfermedades
( Publicado en "Energía para vivir", Bruno Günther y Enrique Morgado,
1998, Editorial Universitaria )


En los últimos años, el enorme progreso logrado en el conocimiento de la inmunología y en las tecnologías de laboratorio para detectar y poner en evidencia reacciones entre antígenos y anticuerpos, ha ayudado mucho en el diagnóstico de las enfermedades. Más aún, con el desarrollo de los anticuerpos monoclonales, que ha permitido obtener en forma continua anticuerpos absolutamente puros, se han reforzado estos avances. Con todo, una nueva etapa se está iniciando, utilizando las tecnologías de Ia manipulación genética.

Nada puede identificar mejor a un microorganismo o a un virus, que el conocimiento de su material genético. De igual modo, más adecuado es identificar al gen anómalo, que identificar a la proteína anómala causante de una enfermedad. Esto no sólo es válido tanto para las enfermedades infecciosas y las genéticas, sino también para eI cáncer y las enfermedades por autoinmunidad. Es en este sentido que el secuenciamiento del DNA, está comenzando a ser una valiosa herramienta para el diagnóstico de diversas enfermedades.

Las dos hebras del DNA, pueden asemejarse a un cierre eclair, que puede abrirse por medio de una reacción bioquímica o por acción de la temperatura, quedando separado en dos hebras independientes. En esta etapa, se agrega un DNA sintético y complementario conocido como sonda, que previamente ha sido marcado. Si existe Ia hebra complementaria, se van a unir por hibridación, para formar de nuevo la doble hebra, pero esta vez una de ellas va a estar marcada (figura 1).

Con este procedimiento se pueden detectar ínfimas cantidades de DNA de células o microorganismos provenientes de una pequeña cantidad de muestra del paciente, como saliva, células, suero, líquido cefalorraquideo y otras. Usando técnicas de microscopio de fluorescencia, se pueden detectar hasta unos pocos virus en el interior de una célula si se cuenta con una sonda marcada con una sublámina fluorescente. La técnica es menos sencilla, cuando se usa una sonda radioactiva, pero aún así se pueden determinar cantidades tan pequeñas como 10-13 gramos de ácido nucleico. Hay que considerar que los métodos convencionales más sensibles (antígeno anticuerpo) logran determinar hasta 10-9.


El DNA en el Diagnóstico de Enfermedades Infecciosas

Tal vez donde más se preste esta metodología es en la identificación de microorganismos. Con ella incluso se pueden discriminar diferentes cepas que por otros métodos no ha sido posible identificar. Así, por ejemplo, la empresa biotecnológica Genética Integrada de USA, ha podido identificar 350 cepas diferentes de salmonellas.

El método es también muy sensible y especifico para detectar enfermedades virales. El Laboratorio de investigación Bethesda de USA, ya está comercializando un kit para detectar el virus de la hepatitis B. El DNA sintético está formado por una secuencia de 3200 bases el que es complementario con el DNA del virus. En ese kit, el DNA marcado con un radioisótopo, se pone en contacto, en un filtro, con el DNA con sus hebras separadas provenientes de la muestra del paciente. Luego, el filtro se lava para remover el material radioactivo no unido y se determina el DNA hibridizado, Ia presencia de radioactividad en el filtro indica Ia presencia del virus. Este kit determina cantidades tan pequeñas como 6 millones de virus por mililitro de sangre. Normalmente en una hepatitis, se encuentran alrededor de 600 millones de virus par mililitro. El test no sólo permite identificar el virus sino también la evolución de la enfermedad.

Ya se están comercializando otros kits semejantes, para detectar el virus del herpes, el adenovirus, el citomegalovirus y el virus de la hepatitis B. Así mismo numerosos otros procedimientos están en diferentes procesos de fabricación o de aceptación por la Administración de Alimentos y Drogas de USA.

En otras enfermedades infecciosas difíciles de diagnosticar por los métodos convencionales, el método del DNA hibridizado puede ser de gran utilidad. Así, por ejemplo, la clamidia, una bacteria de transmisión sexual que causa esterilidad y muerte en las mujeres, es difícil de diagnosticar, debido a que la bacteria crece sólo en cultivos celulares. El método de hibridación solucionaría este problema permitiendo una rápida identificación del microorganismo. Del mismo modo, la identificación de Ia bacteria que produce la gonorrea es difícil, incluso con anticuerpos monoclonales, porque muta demasiado rápidamente y es complicado detectar todas las cepas. Sería posible al preparar una bacteria con los genes más estables de ella usando la sonda adecuada.

Recientemente ha sido aprobado para su comercialización por la Administración de Alimentos y Drogas de USA, un nuevo kit para identificar la Legionella, una bacteria que provoca varios tipos de neumonías, de las cuales la más conocida es la llamada Enfermedad de los Legionarios. La distribución será realizada por la firma Gem-Probe y constituye una variante de los métodos ya descritos. En lugar de hibridizar el DNA de la bacteria o el RNA mensajero, se hibridiza el RNA ribosomal. Este es un tipo de RNA, que normalmente se combina con proteínas celulares para formar los ribosomas (ver capitulo 1""). La mayor ventaja de esta variante es que en cada célula hay miles de copias de RNA ribosomal, lo que aumenta la sensibilidad del método. Este método no requiere cultivo del microorganismo y se puede hacer directamente en el esputo.


El DNA en el Diagnóstico de Enfermedades Genéticas

Durante las últimas décadas se han descrito más de 3000 diferentes enfermedades cuya etiología se debe a la alteración de un gen funcional, el que a su vez codifica una proteína anómala que no cumple su función bioquímica normal, ocasionando una enfermedad. Generalmente la causa de esta anomalía es el cambio de un par de bases del DNA, lo que significa que se codificarán uno a más aminoácidos diferentes en la estructura de la proteína, la cual tiene un alto riesgo de no cumplir la función para la que fue diseñada y si se trata de una enzima, puede alterar toda una vía metabólica y con ello, la funcionalidad celular.

En algunas de esas enfermedades ya se ha logrado identificar el gen responsable siendo posible fabricar un kit para efectuar el diagnóstico. Tal es el caso de las talasemias, donde la proteína anómala es una cadena de la hemoglobina. La anemia que se produce en esta enfermedad es en algunos casos fatal. Un caso similar lo constituye otra enfermedad, que también afecta a la hemoglobina, la anemia de células falsiformes. En este caso se produce la sustitución de un par de bases, en uno de los genes que codifican para una de las cadenas de la hemoglobina, lo que produce el cambio de un aminoácido en la hemoglobina, alterándose de este modo su función. Hasta hace algún tiempo la enfermedad se diagnosticaba examinando esa irregularidad en la proteína, sin embargo, ahora se puede detectar en forma más precoz identificando el gen alterado.
Otra enfermedad, como el Corea de Huntington, también se puede diagnosticar por el mismo método. Esta es una enfermedad fatal del sistema nervioso central que se caracteriza por la pérdida de la coordinación muscular y por el deterioro mental progresivo. En los enfermos los síntomas comienzan a hacerse evidentes después de los 20 años. En la actualidad ya se puede realizar el diagnóstico precoz de esta enfermedad, aún antes de aparecer los síntomas.

Este método está siendo usado también en otras enfermedades genéticas, como la distrofia muscular del tipo Duchenne, que produce parálisis progresiva en adultos jóvenes. También ha sido utilizado en el diagnóstico de la retinitis pigmentosa, una enfermedad de la vista.

Hasta ahora, son pocas las enfermedades en las que se ha podido detectar el gen alterado, dada Ia complejidad del genoma celular, pero no cabe duda que cada día se podrán detectar más enfermedades, sobre todo con el uso de las enzimas de restricción y Ia automatización de muchos de estos procesos. Ya existe una máquina automática que permite estudiar la secuencia de bases del DNA y existe también otra que puede sintetizar secuencias de DNA según programación previa (ver capítulo 14).

Todos estos métodos están permitiendo hacer el diagnóstico prenatal de las enfermedades genéticas. Para esto basta tomar una muestra de líquido amniótico por punción a través de la pared abdominal de Ia madre. Debido a la escasa cantidad de células así obtenidas, se hace necesario cultivarlas para lograr una cantidad adecuada de DNA que permita su identificación.

Sin embargo, se ha comenzado a utilizar un nuevo método que permite tomar una biopsia de las vellosidades coriales de la placenta que proporciona suficiente cantidad de células. Todas las células del cuerpo, contienen la misma cantidad de DNA, ya sea, si codifica una proteína determinada o no. Así, en el caso de la talasemia no sólo está alterado el gen de la célula que produce la hemoglobina, sino que ese mismo gen está también alterado en las demás células, aun cuando no sinteticen la hemoglobina. Por tal motivo, también las células de Ia placenta del feto presentan el gen anómalo de Ia hemoglobina. Así, al tomar una biopsia de Ia placenta se podría teóricamente detectar cualquiera de las tres mil enfermedades genéticas conocidas. La biopsia de Ia vellosidad se puede obtener a las ocho semanas de embarazo, porque en ese periodo el embrión está envuelto en el corión, para de la membrana que constituirá Ia placenta. Este corión tiene en su superficie pequeñas agrupaciones de células, llamadas vellosidades. La biopsia se obtiene a través de la introducción de un catéter, por Ia vagina, guiado por ultrasonido. La biopsia se succiona de una de estas vellosidades.

Hasta ahora son pocas las enfermedades que se pueden detectar por el método de la sonda de DNA radioactivo, pero teóricamente se podrían detectar todas ellas antes de su nacimiento, siempre y cuando se identifiquen los genes, Io que se espera sea posible en el futuro. Con este examen, una pareja puede elegir entre continuar o no con el embarazo. Más aún, recientemente se ha descrito que tempranamente, cuando se anida el huevo en el útero, células indiferenciadas del huevo, llamadas trofoblastos, pasan a la circulación materna y al tomar una muestra de sangre de la madre pueden separarse y estudiar en ellas su DNA. Es decir, bastaría una muestra de sangre de Ia madre para realizar muy precozmente el diagnóstico de cualquier enfermedad genética del futuro hijo.

En Ia medida que el método del DNA se perfeccione, éste aún podría dar mayor información, como por ejemplo, saber si un determinado individuo es heterozigoto para una determinada enfermedad genética. Savio Wov de Ia Escuela de Medicina de Baylor en Texas, USA, usando un oligonucleótido de 19 bases, en el cual se ha identificado el sitio de Ia mutación, ha podido determinar si un individuo contiene genes mutantes o una mezcla de genes mutantes y normales (heterozigoto) a todos normales. El Dr. Wov ha ensayado este método en una enfermedad llamada deficiencia de alfa 1 antitripsina. Se trata de una enfermedad genética en que falla esta enzima y se produce una digestión tríptica descontrolada de tejidos, especialmente en eI pulmón y el hígado, Io que llega a producir enfisema pulmonar y daño hepático. Por esta técnica, se pueden detectar mutaciones en cantidades tan pequeñas de DNA, como 5 microgramos.

En resumen se trata de una tecnología que está en pleno desarrollo y cuyas posibilidades pueden extenderse aún mucho más. Por ejemplo, en el estudio de las susceptibilidades individuales a ciertas enfermedades, o a carcinógenos o a mutágenos. Podrían identificarse a individuos que sean propensos a Ia diabetes insulina dependientes y así intervenir para evitar Ia destrucción de las células beta del páncreas y prevenir Ia enfermedad con vacunas, ya que algunos investigadores piensan que es producida por infecciones virales. Mucho queda por conocer y avanzar en este campo en la medida que se vayan identificando genes que condicionen Ia mayor o menor sensibilidad a diversas enfermedades.


Diagnóstico en el Cáncer

Ya existe un consenso, entre los investigadores, que el cáncer es debido a una alteración del DNA (ver capitulo 8). Es ya un hecho demostrado la existencia de genes que potencialmente pueden inducir la iniciación de un cáncer, como son los proto oncogénicos. Diversos factores pueden inducir el cambio de un gen de proto oncogénico a oncogénico como son las radiaciones, los virus, los mutágenos, etc. Para que este cambio ocurra tiene que modificarse el DNA del gen proto oncogénico mediante una mutación, en una o dos de sus bases. Este gen alterado puede detectarse mediante las técnicas de DNA sintético.

Probablemente esta metodología no sea útil en el diagnóstico precoz del cáncer, desde el momento que los genes oncogénicos están sólo presentes en las células del tumor, pero pueden ser útiles para planificar un tratamiento efectivo, Lamentablemente, una de las características más sobresalientes de la célula cancerosa, es su gran potencial mutagénico, Io que ha postergado considerablemente el empleo de esta técnica con estos fines.

Ya están disponibles varias muestras comerciales con DNA de este tipo, pero ninguno ha sido aprobado aún por Ia Administración de Alimentos y Drogas de USA, por lo que su uso está sólo disponible para investigadores que se dediquen al tema.

En Ia medida que progresen las investigaciones cada día serán más útiles estas técnicas de diagnóstico. Por ahora se puede afirmar que están aún en etapas de desarrollo como lo estuvieron hace veintidós años los métodos que hoy se utilizan aprovechando la reacción antígeno/anticuerpo. Seguramente se continuará investigando en este sentido por la importancia que tiene el diagnóstico precoz de una enfermedad.


2 Respuestas

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