En los últimos años se han logrado avances significativos en el diseño de los fermentadores así como en el grado de control que se ejerce durante el proceso de fermentación. El fermentador no es más que un instrumento que permite al operador controlar el estado del medio de cultivo, el cual determina el crecimiento y producción de un microorganismo. De ahí que este artículo tratará, en primer término, sobre algunas características fisiológicas generales de los microorganismos que deben ser consideradas durante la fermentación. Luego nos referiremos a los nutrientes necesarios para sostener el crecimiento y, finalmente, a los medios tecnológicos para lograr la óptimainteracción entre nutrientes y microorganismos, con el fin de obtener el metabólico deseado con la máxima eficiencia.


Requerimientos fisiológicos del crecimiento microbiano

Para su crecimiento, los microorganismos utilizados en los procesos tecnológicos, requieren estrictas condiciones del medio ambiente, tales como:

Medio acuoso.Todas las reacciones biológicas se realizan en presencia de agua. Esta última es por lo general el principal componente del medio de cultivo. Incluso aquellos microorganismos que crecen en un medio sólido como granos de cereales, pajas a heno, necesitan que estos sustratos estén humedecidos para poder colonizarlos.

Temperatura de crecimiento. Las temperaturas entre las cuales se puede desarrollar una célula microbiana varía entre 10 y 600C. Según el rango de temperatura en el cual el crecimiento es posible podemos distinguir microorganismos sicrófilos (4-25 0C), mesófilos (30-40 0C) y termófilos (40-65 0C y más).

La temperatura del medio de cultivo dentro de un fermentador es medida en forma continua gracias a una termocupla inmersa en él. Esta última está conectada a un sistema de calentamiento-enfriamiento del fermentador, el cual permite mantener la temperatura constante durante toda la operación.

Acidez. El pH de crecimiento de los microorganismos varía entre 3.0 y 8.0. En forma general, las bacterias crecen a pH cercanos a la neutralidad (pH 7.0), con la importante excepción de las bacterias lácticas que resisten pH ácidos. Por el contrario, la mayoría de los hongos filamentosos y levaduras prefieren pH ácidos, de alrededor de 5.0. Esta ácido-tolerancia otorga una ventaja importante a las fermentaciones con hongos, ya que el riesgo de contaminación bacteriana es bajo.

Durante la fermentación, hay producción o consumo de ácido en el medio según el microorganismo, lo cual produce una variación del pH. Este último es detectado gracias a un electrodo inmerso en el medio. Este electrodo acciona dos bombas (una con ácido y otra con álcali) que equilibran constantemente este parámetro.

Presión parcial de oxígeno. Se distinguen dos tipos de microorganismos en función de su requerimiento en oxígeno: Los microorganismos aerobios, para los cuales la disponibilidad del oxígeno es indispensable; y los microorganismos anaerobios, para los cuales el oxígeno es tóxico. Existen, por último, algunos microorganismos capaces de adaptar su metabolismo a las condiciones de oxigenación imperantes en el medio y que son por lo tanto aerobios facultativos (éste es el caso de Escherichia coli y Saccharomyces cerevisae, entre otros).

La fermentación aerobia es hasta hoy la más utilizada ya que el crecimiento es mucho más rápido en aerobiosis que en anaerobiosis. Sin embargo, los microorganismos anaerobios son capaces de sintetizar una serie de compuestos únicos (metano, etanol, solventes, etc), lo que ha provocado un nuevo interés en su cultivo y estudio, en particular para la industria química. Por otra parte es necesario mencionar dos limitantes que presentan las fermentaciones aerobias:

a) Muy baja solubilidad del oxígeno en el agua, lo que hace necesario airear y agitar fuertemente el medio de cultivo.

b) Producción elevada de calor que debe ser constantemente removida a fin de mantener estable la temperatura.

Las concentraciones de oxígeno y CO₂ disueltos en el medio son controladas por sondas de O₂ y CO₂, respectivamente.

Nutrientes requeridos para el crecimiento de microorganismos

En primer lugar, el microorganismo requerirá de una fuente de carbono de la cual extraer la energía necesaria para su metabolismo. Las fuentes de carbono más comunes son los hidratos de carbono, tales como almidón y azúcares.

Durante los años sesenta, algunos hidrocarburos derivados del petróleo fueron intensamente estudiados como fuentes de carbono de bajo costo. Esta situación cambió radicalmente en la década del 70, debido al alza del precio del petróleo y hoy en día, por el contrario, se investiga la conversión biológica de hidratos de carbono en combustibles. En la búsqueda de nuevas fuentes de carbono, se está estudiando, desde hace poco, la utilización de recursos lignocelulósicos (pajas de cereales, árboles y sus residuos, etc.), principal fuente de biomasa renovable (capítulo 4).

Muchas de estas fuentes de carbono requieren un pretratamiento previo a su utilización; es el caso, por ejemplo, del almidón que debe ser cocido e hidrolizado hasta glucosa antes de ser trasformado en etanol por los microorganismos que realizan esta transformación. Es también el caso de la celulosa y de los substratos lignocelulósicos en general, los cuales necesitan drásticos tratamientos físicos y/o químicos antes de ser utilizables con este fin.

Otros nutrientes que son necesarios en cantidades importantes para el crecimiento microbiano son el nitrógeno, el fósforo y el azufre. Estos elementos son incorporados en las moléculas estructurales y funcionales de la célula. El nitrógeno, en particular, debe ser provisto en proporciones variables bajo la forma de nitrógeno proteico obtenidos a partir de subproductos de la industria del maíz, extracto de levadura u otros, y no proteico (sales de amonio, urea, etc.). Los otros dos elementos son entregados como sales de fosfato y sulfato, respectivamente.

Por último, una serie de micronutrientes (vitaminas, hierro, cobalto, cobre, zinc, etc.), deben ser suministrados al medio.

La determinación de varios de estos nutrientes en forma continua durante la fermentación permitirá en un futuro próximo espectaculares avances en el control de los procesos. Esto ha sido posible gracias al reciente desarrollo de sensores o electrodos biológicos (enzimáticos y microbianos). Esta tecnología, novedosa y específica, promete un gran desarrollo en un futuro próximo, ya que tiene grandes ventajas en materia de análisis, tales como respuesta rápida, aplicación en muestras coloreadas, uso repetido de los biocatalizadores, etc. El principal problema para su puesta en operación es la dificultad de esterilizar el biosensor sin inactivarlo.


Tipos de fermentadores

Un fermentador es un recipiente de vidrio o acero inoxidable si el uso es farmacéutico, o de material menos noble, como acero al carbono, en el caso de aplicaciones menos exigentes en pureza. Por lo general, el reservorio tiene una altura 2.5 a 4 veces superior a su diámetro, y en función de la aplicación, su volumen varía entre 1000-10 000 lt en el caso de un producto farmacéutico, a 1500000 lt, y más en el caso de la producción de microorganismos como fuente de proteína animal.

El diseño de un fermentador, aparte de asegurar que la operación sé desempeñe en forma aséptica, debe responder a tres requisitos principales: Mezcla adecuada, buena trasferencia del oxígeno del aire al microorganismo y remoción del calor. Este último imperativo explica que, a pesar de las bajas temperaturas a que operan los procesos biológicos con respecto a la catálisis química; sea necesario considerar superficies importantes de intercambio térmico dentro del fermentador para mantener la temperatura de crecimiento. Esto explica también en parte el interés que presentan los microorganismos termófilos, capaces de trabajar a temperaturas más elevadas que otros microorganismos, lo cual reduce por una parte los problemas de remoción de calor durante la fermentación y, por otra parte, los riesgos de contaminación por los microorganismos mesófilos.

En forma general existen tres tipos principales de fermentadores para cultivos aeróbicos (figuras 1 y 2):

1) Estanques aireados agitados. Estos son los más tradicionales y tuvieron un gran desarrollo durante los años 50 y se usan para la producción de antibióticos como la penicilina a escala industrial. El diseño implementado en aquella época se ha mantenido hasta hoy, a pesar que se han efectuado varias modificaciones importantes, en particular en el sistema de agitación.

El fermentador agitado consiste en un cilindro vertical que posee varios deflectores para prevenir la formación de un torbellino durante la agitación. El aire estéril penetra por la base del reservorio, a través de un distribuidor circular. El eje vertical lleva una o varias hélices en función de la relación altura/diámetro. En los últimos veinte años, varias compañías han modificado los agitadores de sus fermentadores, con el fin de disminuir los gastos en energía de agitación.

A pesar de que este modelo de fermentador no es el más económico de instalar ni de operar, sigue siendo el más corrientemente utilizado desde los últimos treinta años. La razón de su éxito reside en su gran versatilidad para ser usado a cualquier escala de producción y para un gran número de procesos sin modificaciones del diseño. Por lo tanto, los costos relativamente elevados de inversión y operación se encuentran compensados por su flexibilidad.

2) Reactores tubulares (Air-1ift). Se trata de un reactor en forma de torre o columna, en el cual el aire es introducido en la base del tubo, y la ascensión de las burbujas de aire constituye el único tipo de agitación existente.

A pesar de que el modelo agitado permite concentraciones superiores de biomasa, el fermentador tubular, por su simplicidad y costos inferiores de energía, mantención e instalación, es preferido en algunos procesos al anterior. Estos fermentadores son utilizados en la producción de cerveza, vinagre y ácido cítrico.

3)< Estanques a recirculación. Todos los fermentadores de este tipo tienen en común el flujo del medio de cultivo en una dirección definida. Esto se ha logrado gracias a la incorporación de tubos de aspiración en el diseño, lo cual permite una recirculación interna del fluido, o por el uso de un conducto de recirculación, el que permite una recirculación externa.

La fuerza motora se desarrolla por el efecto de ascensión de las burbujas de aire (air lift) o por un sistema de flujo hidrodinámico. Existe gran polémica sobre las virtudes de este tipo de sistema, el cual para muchos, es tan eficiente a más que el tanque agitado con respecto a la trasferencia de masa, y con una economía sustancial de energía.

Este sistema es usado, por ejemplo, por la compañía ICI (Imperial Chemical Industries), de Inglaterra, para producir proteína unicelular (ver capítulo 4) en un fermentador de 1.500.000 lt. Este tipo de fermentadores ha producido un interés creciente por la reducción en los costos de producción. Sin embargo, no se conocen bien aún los problemas en la síntesis de un producto que pueden derivar de las fluctuaciones ambientales a las que es sometido un microorganismo en este tipo de fermentadores por la falta de agitación. Por lo tanto, el desarrollo de la investigación en este sentido es indispensable.


Etapas para la obtención de un producto microbiano

La secuencia de etapas envueltas en la obtención de un producto o de células enteras, por fermentación, son las siguientes:

a) Producción del biocatalizador (célula o enzima) o starter. EL costo de los catalizadores que hay que agregar puede ser elevado, en particular cuando se trata de enzimas purificadas. En efecto, en este último caso, el costo de muchas de ellas es tal, que el proceso solo es económico si éstas pueden ser utilizadas varias veces. Por lo tanto, durante los últimos días se han realizado grandes esfuerzos por recuperar la mayor cantidad de catalizador de cada ciclo.

Una forma de realizar este objetivo es reciclar las células microbianas a las enzimas. Esto resulta muy difícil de operar con las enzimas y provoca a menudo lesiones en las células y contaminación con organismos foráneos del reactor.

Otra manera de reducir las pérdidas del catalizador, es manteniéndolo dentro del fermentador, inmovilizado. Esto se logra gracias a la transformación de la enzima soluble o de la célula microbiana, en una nueva forma de catalizador, una forma fija sobre un soporte sólido (figura 3).

El primer método de inmovilización que fue desarrollado y el más simple, es la adsorción: Las enzimas o células se adhieren por atracción física a la superficie de un material inerte como celulosa, carbón, arcilla, entre otros. Una unión más estrecha y estable puede resultar de la formación de un enlace químico, covalente, entre el catalizador y el soporte. Este último puede ser de celulosa, perlas de vidrio, plásticos o polímeros sintéticos. En estos dos tipos de inmovilización, el soporte se encuentra bajo la forma de partículas de pequeño tamaño lo que permite una gran superficie de contacto entre el sustrato y el catalizador. Un tercer tipo de inmovilización consiste en atrapar el catalizador en una matriz formada por un polímero como almidón, sílica u otros. Otro tipo de atrapamiento es la microencapsulación. Esta consiste en encerrar el biocatalizador en una cápsula de un diámetro muy pequeño, del orden de los 100 micrones. La cápsula funciona como una membrana semi-permeable: deja pasar las pequeñas moléculas de sustrato y producto libremente, pero retiene las más grandes (enzimas o células).

Estos biocatalizadores inmovilizados, pueden tener varias formas (cilindros, hojas, partículas, etc.) y han sido utilizados en todo tipo de reactores.

Las potencialidades de la inmovilización de enzimas y en particular de células enteras son considerables, ya que se ha demostrado que no sólo se puede reutilizar el biocatalizador, sino que, muchas veces, los rendimientos y la vida media de éste aumentan en forma significativa. Sin embargo, muchos problemas deberán ser resueltos, como la elección del mejor soporte, asegurar un control adecuada del pH, suplementar adecuadamente con oxígeno en los casos que sea necesario, etc., para asegurar el óptimo funcionamiento de estos biocatalizadores.

b) Preparación del medio de cultivo (pretratamiento de la materia prima, adición de nutrientes, ajuste de pH).

c) Esterilización del medio de cultivo. Para evitar la contaminación del medio por microorganismos indeseables, es necesario esterilizarlo y mantener condiciones asépticas durante la fermentación (aireación estéril, adición de nutrientes estériles, etc.). Esto se debe a que la mayoría de los productas biológicos obtenidos hasta hoy son producidos en cultivo puro, es decir, por un solo microorganismo. La contaminación de este cultivo por otros microorganismos puede resultar en la destrucción del catalizador, en su inhibición o en la destrucción del producto. Por último, pueden introducirse sustancias tóxicas difíciles de separar del producto que nos interesa (como en el caso de un antibiótico, por ejemplo).

d) Síntesis del producto. En función del producto y del catalizador empleado se determina la modalidad de funcionamiento del fermentador: Continua a discontinua.

En los procesos discontinuos o tipo batch, el aporte de nutrientes es único, el tiempo de fermentación es limitado y el producto es recuperado íntegramente al final de la fermentación por vaciado de la cuba del fermentador. Este método es actualmente el más utilizado para los productos que necesitan condiciones de esterilidad muy estrictas.

En los procesos continuos, en cambio, el aporte de nutrientes es renovado regularmente y el producto es removido al mismo tiempo. Este tipo de procesos presenta varias ventajas con respecto a los procesos discontinuos. Así, por ejemplo, los volúmenes de producción por unidad instalada son muy superiores en un sistema continuo. Por otra parte, el catalizador no es eliminado en este tipo de proceso, lo cual permite economías sustanciales, ya que se considera que el precio del biocatalizador es, por lo menos, igual al de los nutrientes empleados en su crecimiento. Por último y sobre todo, este tipo de cultivo abierto permite una versatilidad inherente de operación, en el cual todos los parámetros (concentración microbiana velocidad de crecimiento, concentración de sustratos y productos) pueden ser controlados indefinidamente.

Existen dos tipos principales de fermentadores continuos: El quemostato, en el cual el crecimiento está controlado por uno o más sustratos que son limitantes, y el turbidostato, que opera a tasas máximas de crecimiento, gracias al ajuste del flujo de nutrientes a una velocidad tal que el crecimiento no se encuentre en ningún momento limitado por ningún sustrato.

La máxima velocidad de crecimiento de un microorganismo es el resultado de las características inherentes de éste, más que la consecuencia de la disponibilidad de nutrientes. En las mejores condiciones, el crecimiento es exponencial. Una disminución en la velocidad de crecimiento puede operarse limitando la disponibilidad de cualquier nutriente esencial. En esta nueva situación el crecimiento se encuentra desequilibrado y los nutrientes divergen hacia otras rutas metabólicas que no son aparentemente indispensables para el crecimiento. Aquellos metabolitos que son producidos cuando el microorganismo se encuentra en fase exponencial de crecimiento, se llaman primarios (ácido cítrico, aminoácidos, alcoholes, etc.), por oposición a los metabolitos secundarios (vitaminas, antibióticos, etc.), los cuales son sintetizados en condiciones de crecimiento sub-óptimas. El tipo de metabolito secundario que será sintetizado dependerá del microorganismo involucrado y del nutriente limitante en el medio de cultivo (carbono, nitrógeno, fósforo, azufre, etc.).

Según el tipo de metabolito requerido, la estrategia de fermentación a seguir deberá en primer lugar tomar en cuenta en qué momento del crecimiento éste se expresa. Así, por ejemplo, en el caso de un metabolito secundario, muchas veces convendrá utilizar un sistema doble de fermentación. En el primer recipiente, Se hará crecer el microorganismo en condiciones óptimas a fin de obtener el máximo de biomasa microbiana. Luego, esta biomasa se trasladará al segundo recipiente donde la limitación de un nutriente particular permitirá la síntesis del metabolito. Este sistema permite también el óptimo aprovechamiento de la materia prima utilizada, la cual sería de otra manera en gran parte desperdiciada.

e) Separación del medio y del catalizador. El producto puede encontrarse dentro de la célula (producto intracelular), como en el caso de la vitamina B12 o la enzima glucosa isomerasa, por ejemplo; también es la situación de los productos obtenidos por transformación genética en Escherichia coli.. O bien puede ser liberado al medio de cultivo (extracelular), como es el caso de la penicilina, amilasa, aminoácidos y otros.

f) Purificación del producto. Si el producto es extracelular, es decir, es excretado al medio por la bacteria, se encontrará relativamente puro, pero diluido en un gran volumen de agua. Si es intracelular (no excretado al medio) estará mezclado con todos los constituyentes celulares y habrá que separarlo de ellos.

En el caso de E. coli, por ejemplo, los productos son intracelulares. En primer término hay que concentrar las bacterias, lo que se logra por filtración o centrifugación.

Para obtener el producto, hay que romper las bacterias, quedando éste mezclado con todos los constituyentes celulares. Para separarlo se utilizan diversos métodos, tales como precipitación con sales o alcohol y/o técnicas cromatográficas, (que separan las moléculas de acuerdo a tamaño, carga eléctrica o por su afinidad por algún reactivo químico).

En cada caso, hay que adaptar las diversas alterativas de purificación y extracción. Dentro de estos procesos, especialmente para los productos de alto valor comercial, los anticuerpos monoclonales están comenzando a ser de gran utilidad (ver capítulo 12). Ella se debe a su tremenda especificidad y sensibilidad. Sin embargo, paradojalmente, esta última propiedad trae problemas en el caso de productos lábiles, ya que la separación final del complejo antígeno-anticuerpo es difícil de romper y requiere de tratamientos drásticos y muchas veces denaturantes.


Fermentación con microorganismos recombinantes

Las técnicas de recombinación de DNA, están permitiendo lograr microorganismos que produzcan las sustancias que se desean, de acuerdo a como hayan sido programadas. El cultivar estas bacterias modificadas en reactores industriales agregan problemas que es necesario considerar. El DNA que se les introduce es extraño a ellas. Al crecer y multiplicarse la bacteria, tiende a eliminar el plasmidio, volviendo así a su condición natural.

Los reactores que deben usarse en estos casos tendrán que tener algunas modificaciones para impedir esta inestabilidad del plasmidio. Cuando se preparan los plasmidios para introducirlos en las bacterias, se agrega un trozo extra de DNA, lo que permitirá la expresión del gen deseado sólo a altas temperaturas. Esto significa que el reactor tiene que tener dos compartimentos: uno a baja temperatura, en que las bacterias puedan crecer y desarrollarse óptimamente sin expresar el plasmidio. Cuando se logra un número suficiente de bacterias, se pasan a un segundo reactor, con mayor temperatura, y allí se activa y transcribe el plasmidio.

El trabajar con microorganismos recombinantes, que son más delicados, requiere también de adaptaciones en los reactores. La mayor parte de las industrias de fermentación tienen, por ejemplo, agitadores convencionales y probablemente sea conveniente modificarlos. De igual forma, el volumen de los fermentadores tendrá que ser menor, para permitir una mayor versatilidad.

Sin lugar a dudas, trabajar con microorganismos recombinantes, tiene muchos problemas que aún no han sido resueltos y que requieren de mayor investigación. El proceso de clonación de un microorganismo, es relativamente sencillo, pero de allí a la producción industrial en fermentadores, hay un largo camino que recorrer. La verdad sea dicha que en esta etapa está uno de los mayores obstáculos para el desarrollo de la biotecnología. Todavía falta mucho que conocer acerca de la fisiología de los microorganismos y su respuesta cuando se introducen genes extraños.

Por ejemplo, la mayoría de las proteínas humanas son glicosiladas (contienen ligada a la parte proteica, residuos de carbohidratos). No se sabe si esta glicosilación es importante para la actividad biológica de la proteína. La que sí se sabe, es que ni E. coli, ni ninguna otra bacteria puede hacer esta glicosilación. Por eso ahora se buscan otras alternativas, como levaduras u hongos filamentosos capaces de glicosilar las proteínas y que, además, tienen la ventaja que pueden secretar al medio la proteína que producen.

En todo caso, las investigaciones siguen avanzando y se siguen produciendo innovaciones, no todas divulgadas a causa del secreto industrial. Por ejemplo, Gene Link, una compañía australiana, está estudiando el efecto de irradiar microorganismos con pequeñas dosis de rayos gama, con el fin de destruir el DNA de las bacterias, dejando indemne el plasmidio. Este produciría solamente la proteína codificada por él.

En todo caso, los problemas que se han ido presentando, no parecen insalvables, y nuevas investigaciones harán que el proceso productivo sea más seguro, eficiente y económico.



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