El primer genoma humano se secuenció hace doce años. En el 2000 se anunció que el borrador ya estaba listo (Está listo el borrador del genoma humano) y que el código definitivo demoraría aun tres años más (para el 2003). (El genoma humano: el gran hito de la biología). El descifrarlo completamente fue una enorme tarea y un gran desafío tecnológico, que demoró 11 años, con un costo de 10 mil millones de dólares.

En aquel tiempo los escépticos se oponían decididamente al proyecto, ya que lo consideraban costoso e inútil. Nada se podría desprender de esa secuencia de 3,2 mil millones de bases que constituían el genoma (adenina, guanina, citosina y timina, las cuatro bases del DNA). "Era un proyecto grandioso que requería de una enorme cantidad de recursos, que iban en desmedro de la investigación científica aterrizada", decían los detractores. Irónicamente, señalaban que si se quisiera leer en voz alta la secuencia de todas las bases del DNA, tomaría nueve años y no conduciría a nada. Que sólo la escritura del genoma, llenaría 200 volúmenes, cada uno del tamaño de una guía telefónica. Más aún, que ya se conocía que el 95% del genoma no codificaba nada y que sólo era basura que se había ido acumulando a través de los millones de años de evolución biológica y que el 5% restante, ubicado en cualquier parte indeterminada del genoma, correspondía a genes que parecían codificar proteínas. Que no había forma de llegar a saber la función de cada uno de esos 100 mil genes por su complejidad e interrelación metabólica (en ese tiempo se suponía que el genoma humano estaba constituido por 100 mil genes) ¿Cómo saber donde partía un gene y donde terminaba?, ¿cuáles de ellos desempeñaban roles primarios y cuales solo roles secundarios?, y finalmente ¿cómo los diferentes genes interactuaban entre sí para ir tejiendo el complejo drama de la vida celular? Eran preguntas que nadie iba a poder responder, al menos con las tecnologías disponibles en ese entonces. Afirmaban que para llegar a conocer ese complejo mundo, eran otros los caminos a seguir. Había que continuar avanzando en la bioquímica celular, y al final de ese camino, tal vez se podría llegar a conocer el programa genético que la guiaba.

Pero habiendo pasado ya algunos años y después que el genoma ya ha sido secuenciado enteramente (2003), las perspectivas se han ido haciendo más atractivas. Los avances se han sucedido más rápido de lo que se pensaba. Paulatinamente se ha ido evidenciando que el denominado "DNA basura" no es tal. Por el contrario, la mayor parte de lo que así se llamaba, se le han ido describiendo diversos e importantes roles regulatorios y de coordinando para el complejo funcionamiento de todos y cada uno de los genes, mientras que al mismo tiempo, y en forma progresiva se han ido individualizando más de mil genes que relacionados con diversos estados patológicos y enfermedades específicas. Se ha observado también que diversas mutaciones genéticas pueden inducir enfermedades similares. Al mismo tiempo se han ido describiendo genes específicos que interactúan con el medio ambiente, ya sea estimulando o restringiendo su expresión. Se puede afirmar que durante los últimos años, gracias al perfeccionamiento de las técnicas de secuenciación, se ha estado incrementando exponencialmente el conocimiento del genoma y su traducción fenotípica. Hasta el año 2010, ya se habían secuenciado en el mundo, más de 30.000 genoma humanos. Con ello ha sido posible ir correlacionando el genotipo con el fenotipo, mejorando enormemente la interpretación del genoma (Rodaje Drmanac. The Ultimate Genetic Test. Science (2012); 336:1110-1111).

Mientras por otra parte, ya se ve como posible y necesario conocer la función de todos y cada uno de los genes en el interior de la célula y su inter-regulación a nivel molecular. Ya resulta evidente que todas las enfermedades tienen sus bases en el genoma (sean mono o poligenéticas) y que a través del conocimiento de los genes respectivos, se puede llegar a conocer los interacciones de ellos y su impacto en un determinado cuadro patológico, sea este de origen psicológico o somático. Del mismo modo se ha avanzado en el conocimiento de la permanente interacción genético-ambiental, y sus consecuencias patológicas. Incluso ya se podría llegar a conocer los detalles moleculares del proceso del envejecimiento y quién sabe si su posible intervención.

Ahora ya sabemos que el genoma es en un 99% semejante para todos los seres humanos, y que es esa mínima diferencia restante la que nos hace genéticamente diferentes a unos de otros, tanto en el aspecto físico, como en las peculiaridades metabólicas, o en la mayor o menor susceptibilidad de contraer determinadas enfermedades. Ese 1%, significan 150.000 diferencias genéticas de un solo nucleótido. La mayor parte de ellas no parecen ser trascendente. Las restantes marcan las diferencias fenotípicas de una a otra persona. En todo caso puede ser importante irlas relacionando cada una de ellas con cambios metabólicos moleculares, con la consecuente proyección fenotípica. Para ello es necesario disponer de miles de genomas adecuadamente secuenciados, y a través de comparaciones estadísticas, correlacionar las diferencias fenotípicas que cada una de ellas condicionaba. De este modo, se podría llegar a conocer la individualidad y funcionalidad de cada uno de los 20.000 genes que en la actualidad se estima que constituyen del genoma humano (no eran 100 mil como se suponía antes).

Durante las dos décadas que han transcurrido, desde la secuenciación del primer genoma hasta ahora, se han ido logrando evidentes avances tecnológicos en la secuenciación de genomas. Ya los costos no son exorbitantes, y se ha disminuido considerablemente la demora y complejidad del proceso (El genoma personal por 1000 dolares). Pero aun así, el genoma por 1000 dólares, hasta ahora no se ha conseguido. Es que todavía, a pesar de los avances, se requiere de complejas maquinarias secuenciadoras, las que cuestan cientos de miles de dólares, además de un completo y bien equipado laboratorio para todos los procesos de la post-secuenciación. Aun los mas avanzados secuenciadores actuales pueden leer solo pequeños trozos de DNA, de no más de 200 bases, y posteriormente viene la tediosa tarea de unir correctamente esos trozos hasta reconstituir el todo (Likam Brunham y Michael Hayden; Whole-Genome Sequencing: The New Estándar of Care?. Science 2012; 336:1112-1113).

Pero ahora, repentinamente, aparece un método milagroso, que si hace posible pensar en la realidad del genoma de 1000 dólares. Según los autores de esta maravilla, se pueden leer grandes trozos de DNA en pocas horas, y a bajos costos. Los autores han denominado "Secuenciador Nanoporo" a su milagro, y lo que han mostrado es un pequeño aparatito que ellos afirman que no requiere de copiar el DNA tantas veces, ni tampoco marcarlo con substancias fluorescentes, ni de otros complicados procesos post-secuenciación. Cuesta creer tanta maravilla (Elizabeth Pennisi, Search for Pole-fection. Science 2012, 336:534-537)

La solución estaba por otro lado

En las "Conferencias de la Biología y Tecnología del Genoma", celebrada recientemente en Miami (Febrero 2012), frente a una nutrida audiencia de científicos, ingenieros y biotecnólogos, Clive Brown, gerente tecnológico de la empresa "Oxford Nanopore Technologie", presentó a un pequeño dispositivo, semejante a un pen-drive, afirmando que con él había secuenciado el genoma completo de un virus, con una simple pasada de su DNA y que todo había demorado seis horas. Mas aún, afirmaba que el aparatito estaría ya en el comercio a fines de año a un precio de 900 dólares ( Duncan Graham-Rove. Secuence DNA in seconds. NewScientest 2012, 213: 23-24).

El aparatito lo denominaron "Secuenciador Nanopore", y se basaba en la utilización de un pequeñísimo poro, que atravesaba la estructura de una proteína, a través de la cual se podía introducir la hebra del DNA y al mismo tiempo ir identificando y registrando cada una de las bases en la medida que se deslizaba entre sus paredes. El poro era tan pequeño, que en una sección transversal de un cabello, podían caber 25.000 de esos miniporos. La proteína estaba sostenida en una membrana lipídica que imitaba una pared celular. Los gestores de esta maravilla eran David Deamer, biofísico de la Universidad de California, Santa Cruz (UCSC) y Daniel Branton, biólogo de la Universidad de Harvard. Según relataron, no había milagros, sino una laboriosa y larga jornada de trabajo, de imaginación y coordinado con diversos otros especialistas. Durante la conferencia afirmaron haber codificado enteramente el genoma de un bacteriófago (un virus que infecta bacterias), cuyo genoma estaba constituido por 48.000 bases. Habían separado el inicio de las dos hebras de su DNA y luego cada hebra la habían pasado por el nanoporo, una primero y la otra después (fig 1). En la medida que pasaban, iban registrando el orden de la secuencia de cada una de las cuatro bases del DNA. Se podía afirmar que era la primera vez que se leía directamente el genoma. La audiencia quedó estupefacta.

La idea le rondaba en la cabeza a Deamer ya en el año 1989, muchos años antes que se formara la empresa Oxford Nanopore. En aquel tiempo trabajaba en otro tema, relacionado con el origen de la vida. Su preocupación lo había llevado a hacer pasar la molécula de adenosin trifosfato (ATP), la molécula de la energía, a través de una membrana lipídica de una célula sintética. Su objetivo era ver como el ATP podía entregar su energía a las enzimas del interior de la célula. Ello lo lograba a través de un canal que atravesaba la membrana. Si el ATP pódía atravesar, ¿Por qué no el DNA? También pensó que con cada base podía cambiar la corriente de iones en forma diferente para cada base del DNA que fuera atravesando el canal. Sería un secuenciador absolutamente diferente hasta lo que en eses entonces se conocía. El problema estaba en que no disponía de ese canal ideal.

Mas allá de la idea

Mas tarde Deamer conversó su teoría con Branton y se pusieron a la búsqueda del canal ideal. Encontraron la posibilidad de utilizar una proteína: la a-hemolisina. Se trataba de una proteína que el Staphylococcus aureus utilizaba para penetrar la pared de los globulos rojos. En esa época conocieron a John Kasianowitcz, un investigador del National Institute de Standards y Recnología (NIST) en Gaithersburg, Maryland, que estaba ensayando un poro producidos a través de esta proteína. Fue asi como pudieron disponer de un nanoporo. Constataron también que podían aplicar un voltaje para producir una corriente eléctrica de los iones potasio y cloro. Con esta experiencia, Kasianowitcz y Branton publicaron en 1996, un trabajo en el Proceeding of the National Academy of Science, en el que informaban que las bases de ácidos nucléicos podían pasar en hilera por un micropolo proteico y que con ello podían simultáneamente detectar la corriente ionica que producía con el paso de las bases. En el artículo, finalmente sugerían que la técnica podía utilizarse para secuenciar el DNA.

Pero según Deamer y colaboradores, después de algún tiempo se convencieron que este microporo no era el ideal, ya que las bases del DNA pasaban demasiado rápido como para dar tiempo de ser identificadas. Había que buscar como hacer mas lento el pasaje. Así nació la idea de utilizar la enzima polimerasa, la enzima que copia el DNA, abriendo las hebras y separando base a base, como las uniones de una cadena de bicicleta (Amplificación de genes: la reacción de la polimerasa en cadena) (fig 2). Ensayaron varias polimerasas de diferentes especies y de otros proteínas, hasta encontrar la que les pareció más apropiada. Se trataba de la polimerasa de un fago llamado ?29, que era capaz de permitir el paso de a una base, a través de la a-hemolisina. Con todo, aún había problema por la forma de la base muy ancha, en forma de callampa, que producía una señal confusa de la corriente iónica. La señal era poco clara, de modo que no permitía distinguir el paso de una base a otra. Había que buscar otra alternativa de poro, que tuviera una geometría diferente a la de la a hemolisina.

Ello lo encontraron en otra bacteria, llamada MspA (para Mycobacterium smegmatis porin A), cuyo poro de la proteína tenía una geometría diferente, en forma de embudo, con una sección angosta suficiente para permitir el pasaje de cuatro bases (fig3). Con todo, aún había limitaciones: la sección angosta transportaba una señal negativa, lo que hacía difícil el paso del DNA por su similaridad de carga. Para resolver el problema contaron con la ayuda de Jens Gundlach, físico gravitacional de la Universidad de Washington, Seattled, quién logró torcer el gene MspA, cambiando la forma de la proteína. Para ello modificó el gene de la bacteria, de modo que la parte angosta del poro fuera neutra. Pero además tuvieron que agregar alguna carga positiva en la entrada del poro, para favorecer el flujo de entrada del DNA. Con estas modificaciones consiguieron que el DNA pasara a través del poro a una velocidad razonable, a razón de una base cada 30 milisegundo. Finalmente tuvieron también que preocuparse de la membrana bilipídica que sostenía el poro, que resultaba ser poco estable. Para ello la remplazaron por un polímero resistente a la exposición de sangre o contaminantes. Solo entonces nació la empresa Oxford Nanopore Technologyes, registrando la patente a nombre de Bayley, Deamer, Branton, Akesson y otros.

Ellos son los fabricantes del pequeño instrumento que Clive Brown mostró en la Conferencia de Biología y Tecnología del Genoma, en Marco Island, Florida, en Febrero del 2012. Productos de todas las investigaciones han construido el llamado MinoOn (figura 4) y una versión mas grande, llamada GridlON para uso en laboratorios. Ambos con la misma tecnología. El DNA se agrega a una solución que contiene la enzima (polimerasa) que se une al final de cada hebra de DNA. Cuando se aplica la corriente se une la hebra del DNA a cientos de agujeros (micro polos de proteína) que están asentados en un polímero de membrana, de un grosor de 10 micrómetros. A medida que el DNA pasa por el poro de la proteína, la enzima agregada va abriendo las dos hebras del DNA que comienza a pasar por el micro polo.

Cada una de las cuatro bases del DNA tiene una carga eléctrica característica, de modo que cuando cada una va pasando a través del micro polo, altera la corriente y con ello da una señal característica, que modifica la corriente a través del poro. Ello es suficiente para determinar cual de las cuatro bases está atravesando el poro. Cada alteración es leída por un lector.

Oxford Nanopore afirma que el aparatito tiene dos grandes ventajas sobre todas los secuenciuadores desarrollados hasta ahora: 1.- El DNA no necesita ser amplificado, un proceso que consume mucho tiempo. 2.- Se pueden secuenciar hebras de hasta 10.000 bases en forma continua, mientras las otras tecnologías solo permiten secuenciar pequeños fragmentos de poco más de cientos de bases. Según asegura Brown, se podría secuenciar el genoma humano completo en 6 horas. La empresa piensa lanzar al comercio aparatos para secuenciar frecuencias cortas, útil para identificar patógenos o realizar "screening" para identificar mutaciones genéticas que pudieran incrementar el riesgo de ciertas enfermedades. Esperan que cuando salga al mercado, cada unidad tenga un valor de 900 dólares. "Es que el genoma a menos de 1000 dólares ya está ad portas".

La medicina del futuro ya está en el presente

La verdad es que si todo funciona como ellos afirman, en un futuro muy próximo va a cambiar completamente, tanto la salud pública como el mismo ejercicio de la medicina, y también de paso a muchas otras áreas de la ciencia. Se puede prever que las aplicaciones serán muy variadas, desde como poder hacer la secuenciación de células cancerosas de una biopsia, al lado de la camilla del enfermo, a conocer la identidad genética de fragmentos de huesos, en el mismo sitio del hallazgo arquelógico.

Cuando ya se vayan identificando cada uno de los 20.000 genes y sus 200.000 codificadores menores (exones) (C.B. Lowe y col., Science 333, 1019 (2011), pasará a ser rutina pedir un examen para conocer con anticipación a que enfermedades cada persona está más predispuesta y así tomar las medidas necesarias para su prevención. También será posible saber que variedad genética posee su genoma, para seleccionar el fármaco mas adecuado para el tratamiento. Al hacer un diagnóstico molecular de cada tipo de cáncer se podrá decidir que fármaco sería el más adecuado. Del mismo modo, el genoma de cada recién nacido permitirá confirmar o descartar las miles de enfermedades de bases genéticas moleculares, como también disponer de la información necesaria para tomar los cuidados de salud correspondientes a lo largo de su vida. Es que el programa genético no solo las enfermedades monogenéticas, sino también las multigenéticas, como la diabetes, y tantas mas. De aquí en adelante, la puerta está abierta.

(Ver publicación en Nature Biotecnology. …http://.scim.ag/science-live)