La preservación de células animales a bajas temperaturas (criobiología) se remonta al año 1866, fecha en la que Montegazza logró mantener vivos espermatozoides después de haber congelado una muestra de semen a –17°C; sin embargo, no es sino hasta el año 1949 que se produce un avance sensacional en este campo. Efectivamente en ese año los Drs. C. Polge, A.V. Smith y S.A. Parkes descubren que la adición de glicerol (crioprotector) al medio de suspensión de los espermatozoides, impide el daño celular provocado por la congelación y descongelación del semen. Usando esta tecnología se ha logrado mantener vivos espermatozoides de varias especies en semen congelado a -79°C. Con posterioridad se ha establecido técnicas que permiten congelarlos a la temperatura del nitrógeno liquido (-196°C) por largos períodos.

La importancia del crioprotector se puede comprender mejor si se considera lo siguiente:

Durante la congelación de las células se forma hielo extracelular lo que lleva a un aumento en la concentración de solutos. Esto provoca a su vez salida de agua desde las células, fenómeno necesario para minimizar la formación de hielo intracelular. La exposición de la célula a altas concentraciones de solutos es tóxica, sin embargo, este daño disminuye al bajar la temperatura. Aunque no está del todo claro la acción del crioprotector, se acepta que ésta se encuentra asociada a la reducción del sistema que se transforma en hielo. Con posterioridad al descubrimiento del glicerol como crioprotector de espermatozoides, se ha podido demostrar que otras sustancias tales como el DMS0 (dimetil sulfóxido, CRECES 5 vol. 3); etilen-glicol, PVP (polivinilpirrolidona), y otros, tienen propiedades crioprotectoras. En general, dos son las propiedades que debe tener un crioprotector, la primera es que sea muy soluble en agua y la segunda es que no sea tóxica para la célula a congelar.


Congelados y vivos

Los primeros experimentos asociados a la criopreservación de embriones de mamíferos se realizaron en el año 1971 per los doctores Whittingham, Leibo y Mazur, quienes demostraron que embriones preimplantacionales de ratón se podían congelar a temperaturas lo suficientemente bajas como para permitir guardarlos por largos periodos. De esta manera se pudo recuperar embriones vivos después de haber permanecido por un largo periodo congelados a –196° C y a –269° C. Sin embargo, desde un punto de vista practico, como veremos más adelante, la temperatura del nitrógeno liquido (-196° C) es suficientemente baja como para permitir su almacenamiento por largo tiempo.

En la práctica de la criopreservación es conveniente recuperar de cada hembra el mayor número de embriones. Esto se logra como una técnica relativamente sencilla destinada a inducir a las hembras a superovular, es decir que ellas ovulen un número de oocitos varias veces mayor al número que ellas normalmente producen, aumentando por lo tanto el rendimiento. La fecundación in vivo o in vitro de estos oocitos llevará a la obtención de embriones de desarrollo y edad conocidos.


Medio de cultivo específico

El estado del desarrollo en que los embriones se pueden congelar varía con la especie, así por ejemplo, en algunas como el ratón, la congelación se puede realizar con éxito en cualquier estado del desarrollo, incluyendo oocitos recién ovulados. En otras como la abeja, la congelación tiene éxito sólo a partir de mórulas (32 células), y en la vaca sólo a partir del estado de blastocisto (64 -128 células). En el cerdo, ningún embrión sobrevive cuando la temperatura se baja de los 15° C.

Por lo anteriormente expuesto, los embriones pueden ser congelados en un medio de cultivo específico. La elección de este medio es muy importante, por cuanto la recuperación y manejo previo a la congelación debe asegurar la sobrevida del embrión.

En resumen, la técnica de la congelación consiste en suspender en una ampolla los embriones en una pequeña cantidad (0,15 ml) de medio de cultivo; a continuación la temperatura se baja hasta 0°C en donde se dejan por algunos minutos; luego se agrega el crioprotector preenfriado a 0°C y se mantiene por breves minutos para que esta mezcla se equilibre. En la criopreservación de embriones de mamíferos se ha usado fundamentalmente glicerol, etilen glicol y DMSO, siendo este último el más usado. El segundo paso consiste en la inducción de formación de hielo, lo que se logra a una temperatura de –5°C. A partir de este momento la ampolla conteniendo los embriones se debe continuar enfriando a una velocidad de más o menos 0.3°C/minutos, hasta alcanzar –40° C. Una vez en esta temperatura la ampolla se transfiere directamente a nitrógeno liquido. También se puede hacer este traspaso cuando se alcanza –80°C. La temperatura de transferencia a nitrógeno líquido debe ser considerada en relación a la modalidad de descongelación, como se vera más adelante.


Animación suspendida

Los embriones que se han transferido al nitrógeno liquido pueden teóricamente permanecer congelados por tiempo indefinido en un estado de animación suspendida, debido a que a la temperatura del nitrógeno liquido se suspende toda actividad biológica. A dicha temperatura el único tipo de reacción que puede ocurrir es la fotofísica, como por ejemplo, la radiación ionizante. Este tipo de radiación puede provocar daño genético durante la preservación a baja temperatura. Tal daño seria acumulativo, debido a que los mecanismos enzimáticos necesarios para reparar el daño están detenidos. Sin embargo es necesario destacar a este respecto dos hechos importantes: el primero se refiere a que el nivel basal de radiación natural es de 0.5 a 1.0 rad/año, y el otro a que menos del 1%de las mutaciones espontáneas que ocurren a temperaturas fisiológicas se pueden atribuir a la radiación natural. Por estas razones se necesitaría entre 200 a 1000 años de almacenamiento para producir una reducción significativa de sobrevida. Se han realizado experimentos en embriones de ratón los cuales se han mantenido congelados por dos años, lapso en el que recibieron un nivel de radiación equivalente a 200 años; cuando estos embriones se descongelaron, no se observó una pérdida adicional de embriones o un aumento en las mutaciones con respecto a los embriones que no fueron irradiados.


Ventajas

Entre las ventajas de la criopreservación se puede destacar que los embriones congelados pueden ser transportados de un lugar a otro en gran número y en forma relativamente simple la posterior descongelación de ellos no requiere de equipos especiales; simplemente basta un recipiente con agua caliente o bien dejar las ampollas con los embriones a temperatura ambiente. La modalidad de descongelamiento, por lo tanto, dependerá de la temperatura a la cual son pasados al nitrógeno líquido. Si los embriones a transferir estaban congelados a –40° C, la descongelación se debe hacer en forma rápida (350°-450°C/min); en tanto que si ellos estaban congelados a –90°C la descongelación debe ser lenta (20° C/mm).

El método más directo para evaluar la viabilidad de los embriones consiste en cultivarlos in vitro por 24 horas, si éstos continúan dividiéndose ellos se pueden transferir a hembras seudopreñadas, es decir a hembras que desde un punto de vista funcional y endocrino se comportan como si estuvieran preñadas, pero que no tienen embrión en su vía genital (oviducto o útero). Si no es posible para el estudio de vitalidad, cultivar los embriones, existen reacciones de coloración vital que permiten una evaluación inmediata de la sobrevida embrionaria y que no interfieren con el desarrollo posterior.

En algunas especies de mamíferos, específicamente roedores, se han podido también congelar oocitos recién ovulados, los que después de ser descongelados han sido fecundados in vitro sin observarse diferencias con respecto a oocitos no congelados.


Genoma

¿Qué ventajas tiene la congelación de embriones con respecto a la congelación de oocitos y/o espermatozoides? Parecería claro que una ventaja importante de los embriones congelados es que ellos pueden dar origen a un organismo cuando son transplantados en una hembra seudopreñada. Este es un enorme beneficio desde el punto de vista de la producción animal debido a que congelando el embrión se está almacenando el genoma diploide, lo que tiene obvias ventajas con respecto a la preservación de los gametos. Las proyecciones de tipo práctico parecerían ser bastante claras en el caso de la producción animal. Actualmente se está explotando esta tecnología en el manejo genético en bovinos. Las facilidades de transporte de grandes cantidades de embriones de buena calidad genética permitirán reemplazar, en periodos relativamente cortos, la población ganadera de una región o de un país. Por otra parte esta técnica ofrece la posibilidad de almacenar congelados cepas de animales de laboratorio, evitándose así el enorme costo que implica su mantención en viveros. En el momento requerido ellos pueden ser descongelados y los embriones transplantados a hembras seudopreñadas y así recuperar en cualquier momento la cepa deseada.


En el ser humano

Las posibles aplicaciones que esta técnica pueda tener en el tratamiento de infertilidad humana pueden empezar a vislumbrarse cuando ella se asocia a la técnica de fecundación in vitro de oocitos humanos. En 1981 en Australia el Dr. A. Trounson congeló embriones humanos preimplantacionales, producto de una fecundación in vitro.

Sin embargo, hasta este momento no existen evidencias de que ellos sean viables, ni tampoco se sabe que se hayan reimplantado en el útero de alguna mujer receptora; de ser viables estos embriones podría ser de considerable ayuda en el éxito de la práctica de la fecundación in vitro, en parejas con problemas de esterilidad por anomalías del oviducto de la mujer. Esto se debe a que normalmente en la práctica de la fecundación in vitro de oocitos humanos se trata de obtener y fecundar más de uno a fin de asegurar el éxito de esta técnica. Ahora bien si todos ellos se fecundan y todos ellos se desarrollan normalmente, el médico se vera en la disyuntiva del destino de aquellos que no serán reimplantados en la mujer en tratamiento. Una alternativa seria reimplantar algunos (uno o dos) y el resto guardarlos congelados para ser reimplantados con posterioridad cuando la mujer desee comenzar otra gestación.

Estas son obviamente posibilidades que se presentan desde un punto de vista biológico, sin embargo hay consideraciones de tipo ético y moral, no examinadas aquí, que deberán considerarse en la eventual aplicación de esta técnica en humanos.



Claudio Barros


Laboratorio de Embriología
Pontificia Universidad Católica de Chile