Todos estos mecanismos ocurren normalmente en el interior de las células, pero ¿Cómo es que el hombre puede manipular esos genes? ¿Cómo puede cortar un gen de una célula y transferirlo a otra? ¿Cómo puede lograr que ese gen transferido, comience a dirigir la síntesis de una nueva proteína? ¿Cuáles son las herramientas que posee el hombre para lograr ésto? Todo esto se ha logrado porque ha sido posible conocer y aislar las enzimas que participan en estos procesos en la célula. Además, la utilización de vectores, como son los virus y plásmidos que pueden penetrar al interior de las células, transportando trozos de DNA, constituye la base fundamental de la manipulación genética.

Para explicar cómo se utilizan estas herramientas de la ingeniería genética, es necesario describir algunos aspectos técnicos. La primera etapa para utilizar estas enzimas, es poder extraerlas desde el interior de las células. Imaginemos que esas células sean bacterias (cada bacteria es una célula), lo primero que tenemos que lograr es disponer de una buena cantidad de ellas. Luego habrá que proceder a romper sus envolturas externas para así poder liberar las enzimas. Esto se puede realizar por muchos métodos, siendo uno de ellos el mezclar las células con pequeñas perlas de vidrio y moler todo esto en un homogenizador. Así obtenemos un extracto celular. De este extracto que contiene una mezcla de muchas enzimas, hay que extraer y purificar la enzima que se necesite. Numerosos procedimientos de laboratorio permiten esto: precipitación con sales, cromatografía, ultracentrifugación, cambios de pH, incubación a diferentes temperaturas, filtración en geles, etc.

Una clase de estas enzimas, son las llamadas endonucleasas de restricción, que son un grupo de enzimas que podrían analogarse a verdaderas tijeras, que permiten cortar el DNA en forma muy específica, en puntos precisos de la molécula. Ellas reconocen en una molécula de DNA, secuencias precisas de bases (o nucleótidos). Generalmente son secuencias de tres o cuatro bases, siendo cada endonucleasa de restricción específica para alguna de éstas. El punto donde se produce el corte, se llama sitio de restricción. La enzima corta en ese sitio, las dos hebras de DNA, aunque el corte puede no ser exactamente opuesto en una y otra hebra (como se aprecia en el ejemplo de la figura 1). En definitiva, estas enzimas cortan el DNA en fragmentos cada vez que encuentran la secuencia de bases determinadas.

Existen numerosas endonucleasas que cortan el DNA en diferentes partes, y que ya están disponibles en el comercio, constituyendo herramientas indispensables para el biólogo que quiere manipular los genes.

Estos cortes dejan extremos del DNA que son complementarios y cuando se vuelven a encontrar tienden a unirse nuevamente. Este proceso de unión lo realiza otra enzima, denominada DNA ligasa, con lo que puede repararse el corte que ha realizado la endonucleasa de restricción (figura 2). Estos dos tipos de enzimas, son fundamentales para manipular los genes.

Todas estas enzimas se han extraído de bacterias y parecen ser parte de los mecanismos normales de defensa de estos microorganismos, porque protegen a las bacterias contra la infección de virus (los virus están constituidos por DNA o RNA, más una envoltura proteica externa). Estas endonucleasas pueden discriminar entre el DNA de la célula y el DNA del virus invasor, ya que de otra forma destruirían su propio DNA. El proceso de reconocimiento comprende dos aspectos: primero, el reconocimiento de una secuencia específica de bases y segundo, al hecho que la bacteria es capaz de colocar elementos químicos protectores en esas mismas secuencias para impedir que se corte su propio DNA. El DNA invasor, que carece de esta señal protectora, es así destruido. Es la lucha molecular para la sobrevivencia.

Para poder trabajar con el DNA de una célula cualquiera y someterlo a estos cortes enzimáticos, es necesario previamente extraer el DNA desde el interior de las células. Para esto hay que proceder a romper las células, las que se colocan en un homogenizador, agregando un detergente. De la mezcla que queda, Se extrae el DNA. Como es una molécula muy larga, más larga que todas las otras, se ha encontrado un método muy fácil. Se hace girar dentro de la solución una varilla de vidrio y en ella se pega el DNA en la misma forma que un tenedor permite enrollar los tallarines en un plato. Sobre este DNA separado se hacen actuar las enzimas de restricción que son capaces de cortarlo en los fragmentos que se desee. Cada uno de esos fragmentos puede tener uno o varios genes que contienen la información para sintetizar una o varias proteínas.

Son estos trozos de DNA incorporados a un vector, los que pueden introducirse dentro de una célula, por ejemplo, una bacteria, y lograr que ella comience a expresar esa secuencia de DNA, utilizando su propia maquinaria enzimática y sus propios ribosomas. Es decir, se puede engañar a la bacteria para que produzca lo que nosotros deseamos. Imaginemos, por ejemplo, que nos interesa producir la hormona de crecimiento humana. Esta es una proteína formada por una cadena de aminoácidos relativamente corta. Para ello tendremos que disponer de células humanas, romper sus membranas, extraer su DNA, cortarlo con enzimas de restricción, escoger el trozo, que contiene el gen que lleva la información e introducirlo en una bacteria (generalmente E. coli), la que entonces va a comenzar a sintetizar la hormona de crecimiento humana. Esto es ingeniería genética. Sin embargo, no es tan simple introducir ese gen al interior de la bacteria ya que está protegida por una membrana. Para ello se requiere de un vector o transportador que permita el ingreso al interior de la bacteria. Tal es el caso de los plásmidos y bacteriófagos (son virus que destruyen a las células, introduciéndose en ellas).

Vectores: Plásmidos y bacteriófagos. Ciertos tipos de moléculas pequeñas de DNA son infecciosas, en el sentido que pueden penetrar al interior de las células y utilizar la maquinaria de ella para reproducirse. Ellas, en realidad, no son moléculas vivas, ya que no se pueden reproducir en forma independiente. Requieren de las enzimas y organelos celulares para transcribir su DNA en un RNA mensajero y traducir este mensaje en una proteína. Algunos de estas DNA son muy nocivos para la célula porque terminan matándola, tal es el caso de los virus, otros en cambio, como los plásmidos, pueden ser incluso beneficiosos para ella. Los virus tienen su DNA envueltos por una cubierta protectora formada por proteínas y de este modo pueden vivir largo tiempo fuera de la célula. Los plásmidos, son moléculas de DNA circulares desnudas, que sólo pueden sobrevivir en el interior de las células.

Los virus que infectan las bacterias se llaman bacteriófagos. Su DNA puede ser utilizado en ingeniería genética ya que también es cortado por las enzimas de restricción en sitios específicos, y por lo tanto empleado para insertar en él pedazos de DNA de otra fuente. A pesar de ello, mantienen toda su capacidad de infectar la célula. Es por esto que los bacteriófagos son los vectores ideales para introducir al interior de la célula el trozo de DNA que deseamos, tecnología que se ha Llamado clonación molecular.

Los plásmidos en cambio son pequeñas moléculas de DNA circulares de doble hebra que aparecen naturalmente en el interior de las bacterias. Estos plásmidos se reproducen en forma independiente del cromosoma bacteriano, puesto que contienen su propio origen de la replicación. Ella es una región que le da la información inicial para que la maquinaria enzimática de la célula comience a replicar su DNA. En el interior de las bacterias se han descrito muchos tipos de plásmidos. Los más pequeños, que se usan para la clonación, tienen unos 5 mil pares de nucleótidos, lo que es suficiente para codificar una proteína de tamaño mediano. Para comparar, una bacteria E. coli tiene en su DNA más de 5 millones de pares de nucleótidos, mientras que una célula humana tiene 5 mil millones de pares de nucleótidos.

Un importante aspecto del DNA de algunos plásmidos es que contienen genes que permiten a la bacteria adquirir resistencia a ciertos antibióticos. Es por esto que los plásmidos son beneficiosos para las células. Estas propiedades de traducido tamaño y de resistencia a antibióticos, son los que han permitido su utilización en las tecnologías de manipulación genética. Así, por ejemplo, imaginemos que usamos un plásmido para insertar un trozo de DNA que se quiere introducir a la bacteria que contiene la resistencia a la penicilina. El plásmido se agrega al caldo de cultivo de bacterias que normalmente son afectados por la penicilina. Bajo condiciones experimentales apropiadas, el DNA del plásmido entra a la célula y se multiplica junto con el DNA de la bacteria (transformación). Luego las bacterias se traspasan a placas de agar que contienen penicilina y se incuban por dos días. Coma resultado, la mayor parte de las bacterias mueren, pero unas pocas sobreviven, siendo precisamente aquellas las que han incorporado el plásmido. Así se está seguro que todas las colonias que siguen creciendo y desarrollándose, han incorporado el pIásmido en su interior y que, además, contienen el gen que se ha introducido en el mismo plásmido. Mediante estas técnicas del uso de plásmidos que confieren resistencia a los antibióticos, se pueden seleccionar las colonias que interesan y cultivarlas después, separadamente.

En la figura 3, se esquematizan las etapas necesarias para lograr introducir un trozo de DNA humano en el vector circular, que va a servir para infestar posteriormente a la bacteria. Se forma así, lo que se ha denominado, una molécula de DNA recombinante.

En la figura 4, se esquematiza todo el proceso de clonación. Células humanas se rompen (por razones didácticas, se muestra una sola de ellas, pero obviamente son muchas) (etapa 1). Se extrae el DNA, (etapa 2) que contiene el gen que se desea clonar (etapa 3b), el cual se logra cortando el DNA con una enzima de restricción específica (etapa 3). Al mismo tiempo se obtiene un plásmido el que se corta con la misma endonucleasa de restricción (etapa 3a). Luego, el DNA del plásmido y el trozo de DNA de la célula humana se mezclan (etapa 4), y se unen por media de una ligasa (etapa 5), lográndose obtener un DNA recombinante que se transfiere a una bacteria, que lo incorpora a su interior (etapa 6). De allí en adelante, la bacteria se comienza a multiplicar en proporción geométrica, multiplicando también al plásmido con dicho gen incorporado (etapa 7).

La que hemos descrito hasta aquí, es un ejemplo de clonación de un gen humano, en una bacteria a en una levadura, con el objeto de engañar a la bacteria o a la levadura para producir la proteína que deseamos. Pero, las tecnologías se han perfeccionado y es posible también, usando las mismas herramientas, extraer genes de una bacteria. Muchas veces puede ser útil que una determinada bacteria deje de producir una proteína que normalmente está sintetizando y para ella es necesario extraerles el trozo de DNA que codifica dicha proteína. Ello se ha logrado por ejemplo, manipulando bacterias que producen sustancias tóxicas para el hombre o dañinas para los vegetales.

Finalmente, así como se ha conseguido introducir genes humanos en bacterias, también ha sido posible introducir genes a células humanas o a células vegetales, con lo que se ha abierto una gran posibilidad, en la medicina, la agricultura, la industria, etc. En los capítulos sucesivos iremos analizando cada uno de estos aspectos.

En estas dos últimos capítulos, solo hemos resumido en forma muy esquemática, las bases de la ingeniería genética (manipulación genética) con el objeto de hacer comprensible las aplicaciones que trataremos en los sucesivos capítulos para el lector no especializado. Con todo, para aquel lector que requiera mayor profundización, hemos preparado un libro adicional con una explicación más extensa y más técnica de lo ya descrito.



Bibliografía

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