El descubrimiento fue realizado en Cambridge (Inglaterra), en 1975, por Cesar Milstein (un refugiado argentino que escapó de la represión política en su país), y por el suizo George Kohler. Por ello ganaron el Premio Nobel en 1984. En un comienzo no se dio gran trascendencia a la tecnología descrita y sus autores ni siquiera patentaron el proceso.

Hoy ha pasado a ser una herramienta de tremenda importancia en la investigación biológica y de enormes proyecciones en el campo médico. Basta señalar que en el año 1987, la venta de productos fabricados por esta tecnología, superó los 130 millones de dólares y en el año 1990 superaron los dos millones de dólares.

Las células productoras de los anticuerpos son los linfocitos B. Ellos se pueden extraer del bazo y cultivar in vitro, pero no sobreviven más allá de algunas divisiones. La importancia del descubrimiento, consistió en lograr fusionar estos linfocitos B, con células mielomatosas (célu1as cancerosas), que se sabía se podían reproducir indefinidamente en un medio de cultivo apropiado (figura 1). En estas células híbridas, se logró algo fundamental: unir la capacidad de vivir indefinidamente de las células mielomatosas y la de producir anticuerpos de los linfocitos B. Este procedimiento permitió obtener células inmortales productoras de anticuerpos. Todo esto unido al hecho de que cada célula fabrica un anticuerpo específico, de modo que al separar una célula híbrida de las demás, se puede lograr un anticuerpo que será siempre igual.


Técnica de producción

El procedimiento para producir anticuerpos monoclonales demora, habitualmente, cuatro meses (figura 2). Para ello, se inyecta en ratones el antígeno, aún cuando no esté puro. Luego de un período de espera que permite un aumento de los linfocitos B específicos, se sacrifica el ratón y se extrae el bazo, rico en linfocitos. Como primera etapa, los linfocitos que se obtengan del bazo, se mezclan con células mielomatosas (células de un tumor de linfocitos), agregando además polietilenglicol, un agente que facilita la fusión. Con esto se consigue que algunas células mielomatosas se fusionen con linfocitos del bazo, produciendo lo que se llama un hibridoma. Se logra así una célula que combina la capacidad de producir anticuerpos de los linfocitos, con la capacidad de multiplicarse indefinidamente de la célula mielomatosa. No todas las células logran fusionarse (hibridizarse), sino que por el contrario, un escaso número de ellas (sólo una cada 2 x 105 de las células del bazo). De allí que sea necesario eliminar todas aquellas células que no se fusionen (linfocitos y células mielomatosas).

Los linfocitos que no se han fusionado se eliminan solos, porque luego de unas pocas divisiones, mueren. El problema más complicado es eliminar las células del mieloma, que si continúan multiplicándose. Las células mielomatosas que se utilizan para la fusión han sido genéticamente alteradas, de modo que les falta una enzima vital para la síntesis de DNA: la hipoxantina guanina fosforibosil trarferasa. Cuando estas células mielomatosas mutadas se hacen crecer en un medie do cultivo especial, ellas también mueren. Sin embargo, si se logran fusionar con linfocitos normales, sobreviven, porque los linfocitos le proveen la enzima que a ellas les falta. De este modo, al poco tiempo, en el cultivo sólo quedan las células fusionadas (hibridomas).

Luego debe seleccionarse y purificarse, entre todos las hibridomas, aquel que produce el anticuerpo específico que se desea. Muchas técnicas se han utilizado para seleccionar los hibridomas específicos, siendo la más usada aquella que utiliza un radioinmunoanálisis. Para ello, se fija el antígeno específico en el fondo de pocillos de plástico. Luego, a cada uno de los pocillos se agrega el líquido del cultivo donde están creciendo las colonias de hibridomas. En aquellos casos en que las colonias secretan el anticuerpo específico éste va a reaccionar con el antígeno que se ha fijado al plástico, los demás se eliminan por un simple lavado. En este momento se agrega un reactivo (marcado con un radioisótopo) que reacciona solamente con la molécula de anticuerpo monoclonal (generalmente un segundo anticuerpo específico contra los anticuerpos monoclonales). Después de un tiempo de incubación apropiada, nuevamente se lavan los pocillos. Para ubicar el hibridoma que interesa se busca en qué pocillo está la radioactividad (figura 2).

La etapa final, es separar los distintos hibridomas resultantes, con el fin de obtener una población proveniente de una sola célula (clon). Para ello, las células se diluyen hasta lograr que una célula quede en un micropocillo de cultivo. El anticuerpo producido por esta célula y sus progenitoras (clon), es un anticuerpo monoclanal. De allí en adelante estas células se pueden guardar congeladas o cultivar y multiplicar por siempre (figura 2).

Estos hibridomas pueden inyectarse en la cavidad peritoneal de un ratón donde se multiplican y desarrollan como un cáncer secretando al mismo tiempo el anticuerpo deseado. Este método es útil para el trabajo de laboratorio, pero no es práctico ni económico para la producción comercial del anticuerpo monoclonal. Por esto, se ha buscado otra forma para poder reproducir y multiplicar el hibridoma; el método llamado Encapel, que consiste en capsular los hibridomas, en pequeñas esferas (figura 3). Primero se colocan los hibridomas en una solución biocompatible de alginatos (sustancia derivada del alga Gracilaria), y luego se encapsulan con una membrana de polímeros de almidón. La porosidad de la membrana de la cápsula permite que los gases y nutrientes fluyan al interior y que los productos de desechos, salgan de ella. Cuando se alcanza la densidad apropiada de anticuerpos en su interior, las cápsulas se rompen y se recolecta la proteína (figura 4).


Aplicaciones de los anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales constituyen una tecnología que abre enormes perspectivas tanto en la investigación básica como aplicada. En todos aquellos procesos en que ya se estaba utilizando la reacción antígeno/anticuerpo, los anticuerpos monoclonales agregan especificidad y reproducibilidad, con lo que permiten estudiar mejor el fenómeno. De allí que una de las primeras aplicaciones prácticas, ha sido en los ensayos de diagnóstico clínico, para luego utilizarlos en nuevas aplicaciones terapéuticas e incluso en procesos industriales que necesiten de purificación de productos naturales.


Diagnostico clínico

Si bien es cierto que son muchas las posibilidades de usos de los anticuerpos monoclonales, hasta ahora sólo han salido al comercio diversas baterías (kits) para hacer diagnóstico in vitro. Sus posibilidades son muchas, pero lleva tiempo (a veces muchos años) para que los organismos controladores autoricen un nuevo producto para la comercialización. Aún las baterías de diagnóstico in vitro requieren de ese control y evaluación ya que de acuerdo al resultado de estos ensayos el médico tiene que tomar determinaciones. Para ello se requiere que los ensayos sean confiables.

1) Diagnóstico del embarazo. Los ensayos ya conocidos para determinar la existencia de un embarazo, se basan en la determinación de los niveles de gonadotrofina coriónica (hCG) en la orina. La mujer embarazada tiene niveles más altos de hCG. Para ello se han desarrollado técnicas utilizando anticuerpo anti hCG. Sin embargo, con frecuencia se producen reacciones falso-positivas por otras hormonas. Los anticuerpos monoclonales, en este caso, gracias a su gran especificidad, eliminan este problema.

2) Hepatitis viral. Enfermedad que causa grave daño hepático y que se asocia al cáncer hepático. Los anticuerpos monoclonales han permitido desarrollar un ensayo, muy sensible y específico, especialmente útil en los bancos de sangre, ya que se sabe que la hepatitis se trasmite en gran parte por las transfusiones
sanguíneas.

3) Identificación del rotavirus que produce diarrea en el lactante. Ya se han producido anticuerpos monoclonales que ponen en evidencia a este virus en deposiciones u otras secreciones humorales.

4) Genetic System (Seatle, USA), ha desarrollado un test específico para identificar el virus del herpes utilizando anticuerpos monoclonales, con los cuales se pueden teñir células del paciente. Al mirar las células al microscopio, puede hacerse el diagnóstico a los 30 min, en lugar de dos o tres días con ensayos convencionales. Ensayos histológicos similares se están desarrollando para otros virus (incluso el SIDA), parásitos o infecciones bacterianas.

5) Uno de los posibles usos de los anticuerpos monoclonales, es el diagnóstico precoz del cáncer. Algunos tumores secretan diversos antígenos que pueden ser detectados por anticuerpos. Es así como Hybritech, ha desarrollado una batería de diagnóstico para detectar las fosfatasas ácidas prostáticas (PAP), que constituyen un indicador del cáncer prostático.

6) Centour, ha desarrollado otros anticuerpos monoclonales, para detectar antígenos del cáncer del páncreas gástrico y colorectal.

Probablemente en el futuro nuevos anticuerpos monoclonales se desarrollarán para detectar ya sea productos hormonales o de bacterias o virus, mejorando la sensibilidad y especificidad de los métodos clásicos de detección. Por este método, se pueden determinar entre otros, insulina, hormona de crecimiento, estrógenos, progesterona, hormona folículo estimulante, hormona luteinizante, testosterona, glucocorticoides, hormonas tiroideas, trasferrina y muchas drogas (digital, narcóticos, etc.).

7) EL desarrollo de métodos diagnósticos no invasivos, como la tomografía axial computarizada, ha reducido la necesidad de exploración quirúrgica. Sin embargo, estas técnicas a menudo requieren contrastar más las imágenes. Los anticuerpos monoclonales, conjugados con colorantes o radioisótopos pueden ser muy útiles para el estudio más detallado del órgano afectado. Por ejemplo, Centaur (Malvern, Pensilvania), anunció haber desarrollado un anticuerpo monoclonal, para medir el daño cardiaco. Cuando el corazón sufre un infarto, el tejido dañado libera pequeñas cantidades de proteínas musculares (miosina). Basados en este hecho, se fabricó un anticuerpo monoclonal antimiosina y se conjugó con un radioisótopo de vida media corta (Indium 111). Al administrarse este anticuerpo al paciente, éste se une a la miosina en el tejido muscular y se puede detectar, por tomografía axial, midiendo la radioactividad del Indium. Con ello se puede observar la intensidad y extensión de la lesión cardiaca. Siguiendo una aproximación semejante, se han desarrollado anticuerpos monoclonales contra antígenos de superficie de células tumorales, con la cual se puede definir el tamaño y extensión de un tumor, sin necesidad de la cirugía.


Anticuerpos monoclonales en terapéutica

1) Anticuerpos monoclonales se utilizan en la terapia de pacientes con leucemia linfoblástica resistente a la terapia convencional. Un equipo del Hospital Infantil de Boston (USA) y del Instituto del Cáncer, Sidney Farber (Boston, USA), han tratado ya numerosos enfermos.

El tratamiento preconizado por ellos comienza con la extracción de una muestra de médula ósea del paciente, la cual es tratada in vitro con un anticuerpo monoclonal dirigido contra un antígeno presente en estas cé1ulas leucémicas. Se adiciona también un complemento, componente del suero que destruye las células a las cuales se ha unido el anticuerpo monoclanal. Con esto se consigue que desaparezca, de la médula las células leucémicas, quedando sólo células normales. Estas últimas se congelan y almacenan, al mismo tiempo que se somete al paciente a una fuerte irradiación para eliminar todas sus células leucémicas. Luego se infunde al paciente con su propia médula previamente limpiada. Las células normales vuelven a repoblar la médula. Por esta técnica se han tratado varios pacientes que se encontraban desahuciados habiendo conseguido en algunos casos una remisión completa.

2) Uso de anticuerpos monoclonales en el tratamiento del cáncer. La idea es fabricar anticuerpos contra receptores celulares de células cancerosas y conjugarlos con sustancias químicas tóxicas, con radioisótopos o sustancias tóxicas naturales. Se trataría de una especie de bala mágica, destinada a destruir exclusivamente las células cancerosas. Es aquí donde los anticuerpos monoclonales tienen una enorme potencialidad y son muchos los centros quo están trabajando en esta dirección.

Los avances logrados ya han sido analizados en "Cáncer y Manipulación Genética".

3) Anticuerpos monoclonales para prevenir el rechazo del trasplante renal. Recientemente, el Food and Drug Administration (USA), ha aprobado el primer anticuerpo monoclonal para su comercialización y uso clínico. Se trata de un anticuerpo contra las células T, células responsables del rechazo de órganos trasplantados. Por su acción contra estas células, este anticuerpo monoclonal (fabricado por Ortho Pharmaceutical Corporation de USA), ha sido de gran utilidad para impedir el rechazo en el trasplante de riñón.

Este anticuerpo monoclonal se ha mostrado en ensayos clínicos más útil que las drogas utilizadas hasta hoy, porque tiene la ventaja que sólo ataca a las células T y no altera el resto del sistema inmunológico.

4) Uso de anticuerpos monoclonales en la terapia de enfermedades por autoinmunidad. Las enfermedades por autoinmunidad se producen porque el sistema inmunológico reconoce a sus propios tejidos como si fueran extraños y comienza a generar una respuesta inmune contra ellos. En la miastenia gravis, por ejemplo, el sistema inmunológico fabrica anticuerpos contra los receptores de acetil colina (que participan en la comunicación nervio-músculo). Estos autoanticuerpos alteran la contracción muscular normal.

Para el tratamiento de esta enfermedad, se utiliza un procedimiento semejante a la diálisis renal, en el cual la sangre del paciente se hace pasar a través de una columna cargada con anticuerpos monoclonales que captan y remueven los anticuerpos autoinmunes. Este procedimiento de lavado sanguíneo, puede aplicarse a muchas otras sustancias sanguíneas que se desee extraer. Por un mecanismo semejante, también se podrían controlar las alergias. La mayor parte de las alergias se deben a que el organismo produce gran cantidad de anticuerpos del tipo inmunoglobulina E, que reacciona con el alergeno. El tratamiento sería similar a lo descrito para las enfermedades autoinmunes, con la diferencia de que el anticuerpo monoclonal se usa para remover las células que producen las inmunoglobulinas E, eliminando de esta manera la alergia.

Sin embargo, todas estas aplicaciones terapéuticas de los anticuerpos monoclonales, tienen sus problemas ya que pueden producir efectos secundarios no deseados. No debemos olvidar que los anticuerpos monoclonales son moléculas producidas por células de ratón y que ellas mismas pueden servir como antígenos y provocar una respuesta inmune en el paciente. La verdadera solución sería producir anticuerpos monoclonales humanos, lo que disminuiría el riesgo de reacción inmunológica. Sin embargo, hay dos grandes obstáculos. Primero, que no existen células de mieloma humanas adecuadas para ser fusionadas con linfocitos humanos. En segundo término, obtener linfocitos humanos inmunes en suficiente cantidad es muy difícil, ya que no es posible (ético) inmunizar a los humanos o sacarles el bazo como para proveer de linfocitos.

Otro problema para usar anticuerpos monoclonales en la terapia humana es la posibilidad de que se generen complejos antígeno anticuerpo. Se sabe desde hace mucho tiempo que estos complejos pueden dañar el riñón, al mismo tiempo que pueden actuar como antígenos.


Aplicaciones industriales de los anticuerpos monoclonales

Las anticuerpos monoclonales han pasado a constituir un complemento indispensable para la ingeniería genética y la biotecnología. Mediante la ingeniería genética se logra que bacterias u otros microorganismos produzcan sustancias de uso médico (interferon, insulina, hormona de crecimiento, etc.), pero para poder usarlas en humanos, éstas necesitan purificarse, porque junto con ellas hay muchos otros contaminantes (proteínas bacterianas, restos de bacteria u otros contaminantes). Los anticuerpos monoclonales pueden utilizarse para esta purificación. El procedimiento consiste en pasar el material impuro a través de una columna que contiene anticuerpos monoclonales fijos en una matriz y que son específicos para la sustancia que se quiera purificar. Los anticuerpos atrapan esta sustancia mientras todas las impurezas siguen su camino. Posteriormente se trata la columna de modo de romper el complejo antígeno/anticuerpo, quedando así el producto puro.

Esta técnica también se utiliza para purificar vacunas preparadas por ingeniería genética, a cualquier antígeno viral, bacteriano a parasitario. La técnica tiene el inconveniente que para separar el antígeno del anticuerpo se utilizan métodos drásticos que pueden alterar la calidad de la proteína, pudiendo obtenerse productos inactivos.


Aplicaciones de anticuerpos monoclonales en investigación básica

En investigación básica, el uso de anticuerpos monoclonales es imposible de resumir y la literatura científica de los últimos años está plagada de publicaciones en que se utilizan anticuerpos monoclonales con los más diversos objetivos. Ellos se están utilizando, por ejemplo, para caracterizar y purificar nuevas sustancias biológicas, como las interleuquinas, la caquectina, encefalinas, endorfinas, morficeptinas, y muchas otras que constantemente se están describiendo. Otras publicaciones los utilizan como marcadores celulares, ya sea en embriología y en diferenciación celular. Así, por ejemplo, los linfocitos, al microscopio, se ven todos iguales, pero ahora se han clasificado en diferentes tipos, de acuerdo a sus propiedades funcionales. Esta clasificación se realiza con la ayuda de anticuerpos monoclonales.

Del mismo modo, los anticuerpos monoclonales se están utilizando para identificar antígenos en algunas células del sistema nervioso con el objeto de conocer cómo las células nerviosas se interconectan. Se calcula que en el cerebro hay 1010 células nerviosas, con hasta 1000 conexiones cada una. Por tanto existen millones de redes posibles de células, que recién ahora se está comenzando a conocer como se interconectan entre sí. Con su facilidad para captar lo que ocurre en la superficie de la célula, los anticuerpos monoclonales están sirviendo para explorar la intrincada red del interior del cerebro, del mismo modo como podrían identificarse los hilos de colores de un cable eléctrico.

Otras investigaciones los utilizan para estudiar los mecanismos por los cuales las células se reconocen entre sí, formando estructuras tisulares. Parece ser que el reconocimiento de célula a célula, se realizaría a través de moléculas que están en la superficie. Los anticuerpos monoclonales han sido utilizados para bloquear e identificar estas moléculas y así contribuir a aclarar este desconocido fenómeno.

En resumen, la breve historia de los anticuerpos monoclonales, que se remonta a veintidós años, ha provocado una enorme excitación en el campo médico, científico e industrial. Con todo, esta fantástica herramienta está induciendo un cambio que hace muy poco se inició. Milstein y Kohler, en su publicación original tímidamente mencionaban, que los anticuerpos monoclonales podrían ser de valor en el campo médico e industrial. Probablemente ni ellos se imaginaron el enorme cambio que estaban produciendo. Una vez más, un conocimiento básico influye directamente en nuestras vidas.