Ello se ha visto reflejado en el perfeccionamiento de técnicas ya convencionales, como la cromatografía líquida, la cromatografía de alta presión, la cromatografía de gases y el perfeccionamiento de equipos, como los de electroforesis, analizadores de aminoácidos, etc. Entre los nuevos equipos que han aparecido cabe destacar los secuenciadores de proteínas, sintetizadores de genes y más recientemente, los secuenciadores de ácidos nucleicos y los sintetizadores de proteínas. Estos instrumentos están permitiendo automatizar diversos procesos acortando el tiempo y minimizando posibles errores humanos.


Secuenciadores de Proteínas

Mediante este instrumento, se ha logrado automatizar la determinación de la secuencia de aminoácidos que forman una cadena proteica (figura 1). Ellos se han perfeccionado hasta alcanzar una completa automatización.

A las empresas que tradicionalmente se dedicaban a proveer de equipos de laboratorio en estos instrumentos se han sumado otras: Applied Biosystems (Foster City, California) y Pharmacia (Uppala, Suecia).

Aplicación: Al conocer La secuencia de aminoácidos de una proteína, podemos conocer las bases que codifican esa proteína. Es decir, la estructura del gen correspondiente. Se pueden hacer también estudios comparativos de la secuencia aminoacídicas de proteínas parecidas.


Sintetizador de genes

Un procedimiento que cada vez se utiliza con más frecuencia en la tecnología de la manipulación génica es la construcción de genes o trozos de ellos. La célula realiza esta labor con gran eficiencia a través del proceso de replicación del DNA que, al menos en el caso de bacterias, conocemos en la actualidad con razonable precisión. Hoy es posible sintetizar genes, aunque no con la eficicnecia de la célula, utilizando solamente métodos químicos.

Inicialmente, el método consistía en un procedimiento químico largo y tedioso. Recientemente, se ha logrado automatizar este proceso, logrando construir una máquina que se puede programar con la ayuda de un computador.
Las primeras generaciones de estas máquina adolecieron de muchos de muchos defectos, especialmente derivados de la corrosión provocada por los reactivos químicos que se utilizaban. Últimamente, ya con más experiencia, ha sido posible producir una segunda generación, que ha hecho que el proceso sea más seguro y veloz. En la actualidad, por lo menos siete tipos de máquinas para sintetizar genes ya están en el mercado y sus precios oscilan entre 20 mil y 70 mil dólares. (figura 2).

Un sintetizador de DNA (genes), es básicamente una máquina que dispone las bases (adenina, guanina, timina, citocina) en una secuencia programada y que al mismo tiempo va agregando reactivos en tiempos precisos y exactos para lograr la unión de las bases. Para ello, un microprocesador controla el funcionamiento de una serie de válvulas que se conectan y desconectan a fin de permitir que las bases, activadores y solventes, fluyan en una secuencia programada hacia el interior de una columna de reacción. Al final, va entregando el trozo de DNA que le hemos pedido que sintetice (figura 3).

Aplicaciones. La aplicación más importante de estos DNA sintéticos, es su uso para identificar trozos de genes que nos interesen estudiar (ver capitulo 9). El método consiste en construir un trozo de DNA, complementario con el gen que queremos identificar en una muestra (por ejemplo el gen de la insulina o del interferon). Si la secuencia a identificar está presente en la muestra en cuestión, el DNA sintético complementario, se unirá al gen y este podría identificarse mediante procedimientos de rutina.

De este modo, están fabricando baterías para diagnósticos que permiten identificar virus, bacterias, o para caracterizar genes de enfermedades debidas o alteraciones monogenéticas: fenilquetonuria, talasemia, fibrosis quística del páncreas, etc. (ver capitulo 9).

Otra aplicación posible la encontramos en la producción de enzimas modificadas (mutagénesis dirigida a sitio específico) (ver capítulo 15). Supongamos que necesitamos sintetizar una enzima que posea sólo un aminoácido de diferencia con la original. Para ello, debemos fabricar un gen en el que modificaremos el codon correspondiente. Una vez clonado el DNA sintético, podremos obtener cantidades importantes de la enzima modificada.

La misma técnica puede también usarse para la modificación de hormonas polipeptídicas, así como la insulina, la hormona de crecimiento o la beta endorfina. Todas ellas son proteínas pequeñas, formadas por cadenas cortas de aminoácidos.

Por cierto, la más importante aplicación del DNA sintético es la construcción completa de un gen. En 1970, Gobin Khorana, químico del MIT (Masachussetts, USA), por primera vez sintetizó un DNA, en su estado de doble hélice, usando solamente métodos químicos. Ello requirió años de trabajo y un numeroso equipo de técnicos. Hoy en día, con los instrumentos descritos, se puede sintetizar un gen entero en cuestión de semanas.

Marvin Canithers y colaboradores, de los laboratorios Amgen Corp (California, USA) recientemente sintetizaron el gen completo que codifica para el interferon. Esta proteína tiene 180 aminoácidos y es codificada por 600 nucleótidos del DNA. La síntesis de genes es hoy en día una operación rutinaria y son numerosos los Centros y Laboratorios que trabajan en esta área, simplificando así el proceso de clonación en bacterias para producir industrialmente proteínas.

Aunque estos instrumentos realizan tareas que parecen impresionantes, todavía quedan muchos aspectos que pueden mejorarse. Uno de los problemas de la síntesis del DNA, es que el largo máximo de las cadenas que pueden construirse con las máquinas actuales es de 50 a 60 nucleótidos. Este limite existe aunque la eficiencia de cada paso en el acoplamiento es de un 95 a 97% dado que, cuando la cadena ha arcaizado unos 50 nucleótidos de largo, se han acumulado numerosas secuencias erróneas.

Si se logra la capacidad de producir fragmentos dos veces mas largos se facilitará grandemente la síntesis de genes. Considerando que las enzimas que ligan los fragmentos (ligasas) no funcionan con la perfección deseada es claramente preferible unir pocos fragmentos largos, que unir muchos fragmentos cortos para completar un gen. La ligazón apropiada de una serie de 100 fragmentos nucleotídicos permitiría la preparación de genes completos, cuyo largo podría ser de miles de pares de bases.

El sintetizador automático de DNA constituye sin duda un aporte fundamental para la ingeniería genética. Es probable que dentro de poco la síntesis química automatizada permitirá fabricar cadenas más largas de DNA, con lo que estaremos abriendo seguramente una puerta muy importante en el desarrollo de esta apasionante ciencia.


Máquina para conocer la Secuencia de Bases en los Genes

Una nueva máquina automática acaba de aparecer en el mercado y que va a facilitar mucho el trabajo de los biotecnólogos. Se trata de un secuenciador computarizado de DNA que permite leer el orden de los nucleótidos en un gen. El instrumento fue desarrollado en los laboratorios del Dr. Leroy E. Hood, en el Instituto Tecnológico de California (USA), y está siendo producido y comercializado por Applied Biosystems, Inc. (USA) a un precio de 90 mil dólares.

En la última década se habían desarrollado dos métodos basados en la autoradiografías, pero ambos eran lentos y engorrosos. La actual máquina utiliza un método que prescinde de la autoradiografía. Este se basa en la técnica desarrollada por Frederic Sanger, de la Universidad de Cambridge (Inglaterra), que consiste en que la hebra de DNA que se quiere estudiar es replicada como cuatro grupos de fragmentos, usando cada vez una de las cuatro bases marcada radioactivamente. Cada fragmento que termina en la base marcada que se agregó, tiene un nucleótido más que el siguiente. Estos fragmentos se colocan en la parte superior de un gel (uno para cada base). Enseguida se aplica un campo eléctrico que hace que los fragmentos migren por el gel. Los fragmentos se separan en el gel, según su tamaño. Cada fragmento se ve como una banda oscura cuando el gel se expone a una emulsión fotográfica. Leyendo el orden de las bandas a través de las cuatro columnas, una para cada base marcada, el investigador puede determinar la secuencia de las bases en el DNA original. Con todo, este es un proceso engorroso y lento para decifrar la secuencia de bases del DNA.

Leroy Hood, automatizó el método de Sanger manipulando químicamente los fragmentos de modo que cada uno de ellos es marcado por una sustancia fluorescente diferente: verde para adenina, naranja para guanina, rojo para la timina y verde amarillento para la citosina. La mezcla de los fragmentos marcados ea luego colocada en una columna con un gel. Un rayo Laser de argón en el fondo del tubo, ilumina los fragmentos a medida que migran. Un tubo fotomultiplicador detecta la luz reflejada por cada molécula fluorescente en la medida que pasa y envía una señal eléctrica a un computador. El computador traduce cada señal a una base en particular y así determina la secuencia del ADN (figura 4).

Este nuevo equipo que está por salir al mercado, sin lugar a dudas va a facilitar la investigación en ingeniería genética.

Aplicaciones: El disponer de una máquina automática que nos pueda describir la estructura de un gen (la secuencia de sus bases), es sin duda de gran ayuda en la tecnología de la manipulación genética. Ella puede dar información necesaria para posteriormente poder sintetizar un gen y clonarlo o utilizarlo como instrumento diagnóstico en enfermedades genéticas o tal vez más adelante en terapia génica.

Actualmente se discute en Washington, un ambicioso proyecto presentado por el Departamento de Energía para determinar la secuencia de todas las bases del genoma humano, lo cual significa determinar la secuencia de tres millones de bases que lo constituyen. Su financiamiento y realización se discute en el Congreso de USA. Para ello, esta nueva máquina será de gran utilidad. Hacerlo normalmente, tendría un costo de cientos de miles de millones de dólares. Con la nueva máquina, costaría 600 millones de dólares y se lograría realizar en la centésima parte del tiempo. Con todo, si el presupuesto se aprobara, el proyecto demoraría cinco años.


Sintetizador de Polipéptidos y Proteínas

El desarrollo de la ingeniería genética, ha permitido la fabricación de proteínas polipéptidos, mediante la clonación del DNA en bacterias y levaduras (ver capítulo 1 y 2), lo que ha abierto una enorme posibilidad en la medicina y en la industria. Sin embargo, este proceso sería mucho más simple y seguro si la química pudiese sintetizarlas directamente, saltándose el proceso de clonación. Ello se puede lograr en el laboratorio, con pequeñas cantidades, pero no es fácil. Formar una cadena de 10 aminoácidos, para llegar a producir un pequeño polipéptido ya ofrece dificultades complejas. Cada aminoácido, tiene dos puntas y cada una tiene su reactividad particular. Así, para conseguir un simple dipéptido (dos aminoácidos juntos) requiere de maniobras químicas cuidadosas para asegurase que la punta correcta de uno de ellos, reaccione con la otra. Las dos puntas de un determinando aminoácido son el grupo amino (-N7H2 o nitrógeno terminal) y al grupo carboxilo (-COOH o carbono terminal). Para conseguir un dipéptido, se necesita que el nitrógeno terminal de un aminoácido, reaccione con el carbono terminal del otro, resultando así una unión peptídica (-CO..NH). Sin embargo, el carbono terminal de un aminoácido , puede también reaccionar con el nitrógeno terminal del segundo y formar un polipéptido al revés de lo que se desea. Si pretendemos formar un polipéptido de 10 aminoácidos, los posibles polipéptidos diferentes que se podrían formar serían más de 3 millones (lo mismo que diez dígitos en un número de la lotería).

Para impedir este problema y lograr sintetizar el polipéptido que se desee, los químicos se han tenido que agenciar, bloqueando el nitrógeno terminal del primer aminoácido y el carbono terminal del segundo, dejando que se forme así un solo dipéptido. Sólo cuando se ha producido esta unión, se desbloquea el carbono terminal del dipéptido. De esta forma e puede hacer reaccionar con un nuevo aminoácido con un extremo bloqueado y se logra formar el tripéptido deseado.

En el ano 1963 , siguiendo esta metódica, Bruce Merrifield de USA, logró sintetizar una hormona polipeptídica: la bradiquina, en sólo ocho días. La llave del éxito fue un reactivo, una resina poliestirémica insoluble. Por ello obtuvo el Premio Nobel de química, en 1984. Hasta ese momento, el procedimiento químico requería que en cada etapa de la síntesis, los productos fueran separados y purificados. Merrifield, logró eliminar este tedioso procedimiento, agarrando el péptido que se iba formando, a un soporte sólido (la resina antes dicha). Más tarde, en 1968, el mismo Merrifield logró sintetizar una pequeña proteína (ribonucleasa), que contenía 124 aminoácidos.

Hasta ese momento, aun cuando se había demostrado la posibilidad de sintetizar una proteína, ello no era práctico porque significaba un tedioso procedimiento manual. Uno de los principales problemas para automatizar el proceso, era la carencia de un método efectivo para monitorear el fin de una reacción, para iniciar la reacción con el siguiente aminoácido. Ahora parece haberse conseguido. Bob Sheppard, en Cambridge, USA, ha llegado a la automatización completa para la síntesis de un polipéptido o una proteína. Para ello logró colorear los aminoácidos en forma tal, que si reaccionan, el color se desvanece. La reacción se considera terminada cuando el soporte sólido retorna a su color blanco prístino. Ello indica que se puede pasar ya a la segunda reacción.

El truco empleado por Sheppard y su equipo, consistió en hacer reaccionar el carbono terminal de un aminoácido con un grupo especial que da un intenso color amarillo, de esta forma el polipéptido que está amarrado al polímero se pone intensamente amarillo. Este color persiste mientras el aminoácido está reaccionando, pero tan pronto como termina de reaccionar, comienza a desvanecerse el color amarillo.

Perspectivas: Con este descubrimiento, es sólo cuestión de formalizar un programa y diseñar la máquina que lo realiza, con la cual sería posible sintetizar la proteína que se desee, saltándose todo el proceso de manipulación genética. Sin duda que la industria va a estar muy interesada.