Aparte de su elevado poder catalítico, las enzimas desarrollan su acción con una notable especificidad, ya que sólo actúan sobre un tipo muy preciso de sustrato, para trasformarlo también en un tipo muy preciso de producto. Dicho de otro modo, en una mezcla de compuestos químicos diferentes, una enzima particular es capaz de reconocer aquel sobre el cual debe actuar.

Las enzimas están compuestas por muchos aminoácidos (generalmente entre 150 a 300 aminoácidos), pero sólo una fracción de ello constituye el sitio activo, que se pone en contacto con el sustrato, para trasformarlo en el correspondiente producto. Si bien es cierto que las enzimas están formadas por una cadena de aminoácidos, la molécula total no es lineal, sino que está doblada sobre sí misma, en una forma específica y siempre igual, constituyendo lo que se ha llamado la configuración terciaria de la proteína (proyección tridimensional). La forma en que se dobla y configura esta estructura terciaria, depende en último término de los aminoácidos que configuran esa proteína (figura 1). Cada uno de los 20 aminoácidos que el organismo utiliza para sintetizar sus propias proteínas, tiene diferentes cadenas laterales que pueden atraerse o rechazarse permitiendo, así, la estabilización de la estructura terciaria. Del mismo modo, algunos aminoácidos repelen el agua y al doblarse la proteína sobre sí misma, tienden a enclaustrarse en el centro de la molécula, donde quedan protegidos de las moléculas del solvente. Como resultado de todo esto la cadena de aminoácidos, se va doblando y contorsionando hasta formar una estructura densa, que es específica de cada proteína. En el interior de esta molécula o en su superficie, está el sitio activo de la enzima, constituido sólo por dos o tres aminoácidos.

Lo interesante es que si dibujáramos la molécula de la enzima en forma lineal, los aminoácidos que forman el sitio activo, seguramente van a estar muy distante uno de otro (por ejemplo, el aminoácido número 51 y 139 en la secuencia lineal), pero como la molécula toma una configuración plegada y compacta, estos aminoácidos, que forman el sitio activo, quedan contiguos.

En este sitio activo entra el sustrato, quien puede interactuar en diferentes puntos de los aminoácidos del sitio activo, explicándose así la especificidad de cada enzima para cada sustrato. Al entrar en contacto, se producen reacciones de transferencia a donaciones de electrones o protones entre la enzima y el sustrato. Como consecuencia de esta interacción y contacto específico, se produce la reacción necesaria para llegar a un producto, acelerándose el proceso millones de veces y lo que es más importante, haciendo posible que suceda a la temperatura y presión del organismo. De esta manera se consigue que la reacción sea muy eficiente, sin pérdidas o formación de productas intermediarios no deseables.

El hombre ha aprendido a extraer del interior de células (bacterias, bongos, levaduras, vegetales y órganos animales), enzimas específicas y que conservan fuera de la célula, las mismas propiedades y especificidad de acción. Es por esto que las enzimas ya se están utilizando en numerosos procesos industriales, puesto que resulta muy atractiva su especificidad y el hecho de que permiten desarrollar su efecto sobre el sustrato, a bajas temperaturas y presiones normales. Ya se están utilizando en procesos industriales por lo menos 50 enzimas diferentes. Ya sea en la industria química, como en la industria de alimentos o bebidas, en la industria farmacéutica, en la producción de kits de diagnósticos e incluso en la producción de detergentes. Las posibilidades en el futuro son numerosas, sobre todo con el progreso de la manipulación genética.


Posibilidades de la modificación de enzimas

Establecido que la eficiencia de la acción enzimática está dada por su interacción con el sustrato en el sitio catalítico, algunos investigadores se han planteado la interrogante de si esta interacción normal a natural es la más eficiente, y de no ser así, si es posible modificarla.

En la actualidad, es posible remodelar estructuralmente a las enzimas, cambiando algún aminoácido especifico en alguna determinada posición en la molécula enzimática (a menudo en el sitio activo). Este método resulta más preciso que las antiguas técnicas de producir mutaciones en bacterias, exponiéndolas a radiaciones, a luz ultravioleta o a sustancias químicas. Esas metodologías, producían sólo resultados al azar, mientras que ahora está siendo posible, por ejemplo, cambiar a voluntad los aminoácidos del sitio activo de la enzima.

La nueva técnica se ha llamado mutagénesis dirigida al sitio específico. Básicamente, consiste en reescribir las bases del DNA en la secuencia de un gen adecuado para conseguir así cambiar, determinados aminoácidos en la proteína final. Para ello se prepara un gen sintético, utilizando la tecnología ya desarrollada para esto, cambiando uno a más tripletes de bases (codones), para que codifiquen uno a más aminoácidos diferentes en una posición determinada de la secuencia. Este gen sintético, se inserta (se clona) en bacterias que lo copia millones de veces. Finalmente, la misma bacteria expresa este gen clonado, lo que se traduce en una molécula proteica que contiene los nuevos aminoácidos.

La mutagénesis dirigida a sitio específico, ya se utilizó recientemente en Inglaterra, para remodelar el sitio activo de una enzima, la tirosil-t DNA-sintetasa, que actúa en la síntesis proteica. Alan Fresh y David Blow, del Imperial College, de Londres, y Greg Winter, del Medical Research Council Laboratoiy of Molecular Biology (Cambridge), lograron cambiar un aminoácido (la treonina, por la prolina) en una sola posición de la cadena, con lo que lograron una enzima que era 25 veces más activa que la enzima natural.

Mediante el método de mutagénesis dirigida al sitio específico se puede cambiar solo un aminoácido cada vez en una posición, lo que hace muy tedioso y largo el ensayar luego su actividad. Por esto, investigadores de Genetech (USA), han ensayado una nueva técnica, que permite realizar estudios sistemáticos. Ellos sintetizan un conjunto completo de fragmentos de DNA, que contienen los codones de cada uno de los 19 aminoácidos que desean ensayar en una determinada posición del sitio activo. La han llamado método de cassettes. Clonando y expresando cada uno de estos DNA al que se le incorpora la nueva información, se logran producir 19 proteínas diferentes, que difieren de la proteína nativa en sólo un aminoácido. Posteriormente, en cada una de ellas se prueba su actividad y se elige la más eficiente.

El progreso de la computación, está significando una gran ayuda en el proceso de remodelar enzimas. La constitución de gráficos par computación interactiva, se ha convertido en una importante herramienta en el diseño de nuevas enzimas. Con ellos se puede construir la estructura tridimensional de la molécula proteica y predecir cómo cambios específicos de un aminoácido podrían modificar dicha molécula. La modelación por computación ha reemplazado completamente la construcción de modelos físicos de moléculas proteicas, permitiendo a los diseñadores construir moléculas en una pantalla de televisión, eliminando el laborioso sistema de ensayo y error en el laboratorio.

Ello requiere eso sí, de un largo proceso. Primero hay que purificar la enzima y cristalizarla, para asegurar su pureza. Luego hay que conocer la secuencia aminoacídica, de la proteína y finalmente, someter esos cristales a un examen de cristalografía por rayas X, para establecer la posición de cada tomo en el espacio tridimensional, así como su densidad electrónica. La información resultante se procesa en el computador, que calcula y hace un mapa de la densidad electrónica del cristal proteico. El cristalógrafo interpreta esta información y luego va colocando los aminoácidos, de acuerdo a la secuencia previamente conocida, en el mapa de densidad electrónica. Se obtiene así, finalmente, la imagen tridimensional de la proteína (figura 2). Llegar a ello, en una proteína de tamaño mediano, toma aproximadamente cinco años. En la actualidad se ha logrado conocer la imagen tridimensional de aproximadamente 100 proteínas. Es posible que con los avances tecnológicos de detectores electrónicos de rayos X y avances de los soft y hardware de computación, el proceso sea más rápido.

Sin embargo, hay que hacer notar que la cristalografía es un proceso lento y costoso por lo que su progreso no ha sido tan espectacular como el de la computación.

Una vez conseguido el diseño tridimensional, se puede jugar en el computador, ensayando el reemplazo de un aminoácido y su interacción con los vecinos. Así por ejemplo, el reemplazo de un aminoácido por otro, en el sitio activo , puede mejorar o alterar la capacidad catalítica de la enzima. Otras veces, a través de este modelo, puede diseñarse una mejor estabilidad de la enzima. Una forma de lograr que una enzima sea más resistente a temperaturas más altas, es estabilizar la estructura terciaria formando nuevas uniones disulfuro (-S-S-) entre los aminoácidos más cercanos que contengan azufre. Estos puentes reducen la natural tendencia de la cadena de aminoácidos a desdoblarse cuando se eleva la temperatura, de modo que si hay más uniones disulfuros, la enzima es más estable a las temperaturas más altas. Los gráficos tridimensionales que se obtienen en las pantallas de los computadores son muy útiles para seleccionar sitios en los que podrían insertarse uniones disulfuros y así cohesionar mejor la molécula.

La simulación en el computador, permite predecir las perturbaciones que se producirían en la estructura terciaria de la molécula, si se cambiara un determinado aminoácido. Así por ejemplo, se puede calcular la fuerza entre todos los componentes de una proteína frente a diferentes conformaciones. El computador puede seleccionar la forma que requiera menos energía para mantener la estructura terciaria.

Son muchas las empresas de biotecnología que ya están investigando en el diseño y modificación de proteínas, utilizando esta tecnología. Cetus (California, USA), ya ha modificado dos proteínas que se están utilizando para el tratamiento del cáncer el beta interferon y la interleukina -2. En ellas se ha sustituido un aminoácido de la proteína (cistina por serina), de modo que la molécula adquiere una configuración más apropiada cuando la fabrica la bacteria. Estas dos proteínas modificadas, ya se están ensayando en clínica.

La empresa Genex (Gaitherburg, USA), ya ha mejorado la proteasa alcalina, que se usa en los detergentes de usa doméstico para el lavado de ropa. Del mismo modo, se han introducido cambios en la hormona de crecimiento, que ya se está utilizando en clínica. Repligen (Massachusets, USA), está usando la misma tecnología, para modificar la ligninasa. Esta es una enzima producida por bongos, que se pretende usar para degradar la 1ignina, uno de los componentes estructurales de la madera.

Por su parte los laboratorios Miles (Elkart), están trabajando en el mismo sentido, con la quimosina, una enzima que se usa para coagular la leche en la industria quesera. Una vez que la quimosina ha ejercido su acción, se calienta para inactivarla, pero a veces persiste una pequeña actividad y al almacenarse los quesos durante algunos meses, se altera el sabor, lo cual constituye un problema. Lo que está haciendo Miles, es usar la mutagénesis dirigida a sitio específico, para lograr una enzima que se inactive completamente con el calor.

Investigadores de Genetech y Genencor (San Francisco, USA), han ensayado el efecto de la sustitución de un solo aminoácido en la estructura de la subtilicina, una enzima proteolítica que se usa en los detergentes. Parece ser que insertando un aminoácido diferente en la posición 166 (glicina), se aumenta notablemente la eficiencia de la enzima. También se ha ensayado la sustitución de metionina en el aminoácido en posición 222. Este aminoácido se oxida fácilmente, lo que hace bajar la actividad de la enzima casi en un 90%. Muchas otras modificaciones por cassette se están ensayando en esta misma enzima. Ella está siendo motivando por la tremenda cantidad de capitales que mueve la industria de los detergentes.


Posibilidades futuras

El gran desafío para los que trabajan en este campo, no es sólo modificar enzimas ya existentes, sino que llegar a preparar nuevas enzimas, que catalicen reacciones para las cuales no existen catalizadores en la naturaleza. Para esto ya se cuenta con la máquina de genes, que puede sintetizar genes totalmente nuevos (ver capítulo 14). Esta máquina automática puede programarse para sintetizar en 24 horas una secuencia de bases que codifiquen una cadena de 40 aminoácidos. Por este mecanismo se ha estado trabajando en una nueva fórmula para el interferon. Para ello han comparado la secuencia aminoacídica del interferon proveniente de diversas especies animales. Con esos antecedentes, diseñaron un interferon nuevo de consenso, seleccionando las secuencias aminoacídicas que aparecían más frecuentemente en las moléculas de las diferentes especies. Después de esto, la secuencia de aminoácidos seleccionados, se tradujo en imagen de DNA fabricado por la máquina de genes. Luego fue clonado en bacterias. El resultado fue un interferon mucho más activo que el que se conocía de origen humano. Así se encontraron algunos efectos inesperados. El nuevo interferon, protegió de cáncer humano a hamsters, mientras que el interferon clásico, no era capaz. Ya se está ensayando para saber si este mismo efecto lo tiene también en humanos.

Tal vez en este campo puedan suceder muchas otras cosas en el futuro. El código genético de todos los seres vivos, se basa sólo en cuatro letras (cuatro bases), y para formar las proteínas, codifica sólo 20 aminoácidos diferentes. Sin embargo, la química orgánica conoce casi 2000 aminoácidos diferentes, ya sea que se encuentren algunos de ellos en forma natural o que hayan sido sintetizados por el hombre.

¿Qué pasaría, si además de los 20 aminoácidos, que usa el código genético, se utilizaran otros aminoácidos en enzimas sintéticas?. Para eso habría que sintetizarlas directamente, saltándose el código genético. Más aún, los sistemas biológicos han evolucionado en tal forma, que para sintetizar sus proteínas, han utilizado sólo una forma molecular de ellos: La forma levogira (llamada también L). Pero los químicos pueden sintetizar la imagen especular o forma D (dextrogira). Si estos aminoácidos se intercalaran en enzimas sintéticas, podrían aparecer propiedades muy diferentes.

El desarrollo de esta nueva tecnología dependerá de la automatización y mejoramiento de los métodos para sintetizar proteínas con más aminoácidos, evitando así el uso de las bacterias y la ingeniería genética. En la actualidad ya es posible hacer en el tubo de ensayo, cadenas cortas de aminoácidos que contengan entre 50 a 100 unidades. Mediante métodos químico orgánicos convencionales como la síntesis de proteínas en fase sólida, se pueden construir estas cadenas usando perlas microscópicas de poliestireno (por la descripción de este método, ganó el Premio Nobel Bruce Merrifield, de la Universidad de Rockefeller, en 1984). Si se llega a sintetizar cadenas más largas ya no será necesaria la ingeniería genética y podrían sintetizase proteínas enteramente desconocidas en la naturaleza. Es difícil poder imaginar las posibilidades futuras en el campo de las enzimas sintéticas. Se inicia una nueva aventura, que jamás el hombre se había imaginado. Por ahora, la ingeniería de proteínas está naciendo, pero ya se ha demostrado que las enzimas pueden rediseñarse y que aún es posible crear nuevas proteínas. Cuando Las reglas se conozcan mejor y progrese la tecnología, posiblemente se alcanzarán metas insospechadas, llegando más allá de lo que la naturaleza ha sido capaz, en un proceso evolutivo y ordenador.