La gran diversidad de organismos vivos que conforman los reinos animal y vegetal puede agruparse en distintas especies según las diferencias y semejanzas que se observan en sus individuos, pero en último término, y en forma muy reduccionista, cada especie está
definida por el patrimonio genético de sus individuos, que está codificado en la molécula de DNA. Es por esto que resultó sorprendente cuando hace diez años los investigadores norteamericanos Palmiter y Brinster lograron modificar experimentalmente el genoma de un ratón, no induciendo mutaciones aisladas sino insertándole un gen completo ajeno que pertenecía a otra especie; es lo que se ha llamado un transgen. Más aun: este gen lo habían adquirido todas las células del individuo manipulado, era transmitido a la descendencia y además era funcional, es decir, se traducía en una proteína. Como en ese caso se trataba de la hormona de crecimiento de rata, que tenia consecuencias para el organismo completo, los primeros ratones transgénicos, fueron gigantes.


¿Cómo se construye un animal transgénico?

El problema central en este revolucionario procedimiento es lograr que un gen ajeno se inserte en el patrimonio genético de un organismo superior. Ese gen consiste en un fragmento de DNA que debe contener la información necesaria para la expresión de una proteína; es decir, se trata de una molécula bastante grande y con cargas electrostáticas, lo cual impide su paso a través de la membrana plasmática de las células. Por otro lado, el transgén debe ser introducido en estados muy tempranos del desarrollo, cuando el embrión está formado por una o muy pocas células. Sólo de esta manera todas o casi todas las células del individuo adulto resultarán transgénicas, incluyendo las células de la línea germinal que se diferenciarán en oocitos o espermios. Mientras menos células tenga el embrión manipulado, mayor proporción de ellas adquirirá el transgén y por lo tanto aumentarán las posibilidades de que los gametos lo transmitan a las generaciones siguientes, estableciéndose de esta manera una cepa, o línea transgénica, cuyos individuos podrán usarse en distintos estudios.

En la práctica, existen varias maneras de fabricar un ratón transgénico. Difieren en la técnica de introducir el gen, ya sea por microinyección o por infección natural usando virus o retrovirus; difieren también según si la introducción se realiza directamente en el embrión o en otras células que luego se agregan al embrión; por último, también puede variar el estado de desarrollo en el que se realiza toda esta operación, siempre que se practique antes de la implantación. Veamos en más detalle los tres métodos más usados.

1- Microinyección del gen en el oocito fecundado. Este procedimiento asegura que el animal sea completamente transgénico porque todas las células del cuerpo descienden del huevo fecundado. Si el DNA se depositara en el citoplasma sería rápidamente degradado por la acción de enzimas, y por esto la microinyección debe hacerse directamente en el núcleo. Por diversas razones, la microinyección se realiza inmediatamente después de la fecundación, cuando todavía es posible distinguir separadamente los núcleos haploides aportados por el espermatozoide y el oocito, llamados pronúcleo masculino, por encontrarse más cerca de la superficie de la célula, y más tarde los dos pronúcleos se unirán formando el núcleo del embrión.

Toda la operación requiere una manipulación extremadamente cuidadosa y condiciones estrictas de temperatura y pH para no dañar la célula microinyectada que debe continuar el desarrollo embrionario. Es decisivo que el volumen de solución de DNA inyectado sea muy pequeño, no mayor de (10) -12 lt; esta pequeñísima gota contiene cientos de copias del gen que se inyecta, el cual habrá sido preparado previamente usando técnicas de biología molecular.

Pero microinyectar el DNA en el oocito tiene algunas desventajas. No puede controlarse el número de copias que se insertan en el genoma (puede variar entre 0 y 50) ni predecirse los lugares de inserción. Podría ocurrir por lo tanto que el transgén se expresara mucho, poco, o que no se expresara en absoluto, dependiendo del entorno genómico donde por azar se inserte; hasta podría suceder que alterara la expresión de otros genes propios del ratón produciendo anomalías. En el primer caso, el de los ratones gigantes, la hormona del crecimiento de rata se expresaba frecuentemente en grandes cantidades, pero los investigadores también encontraron ratones que no expresaron a hormona, aun teniendo el transgén incorporado. Esta peculiaridad en la inserción del transgén, que puede constituir un inconveniente si se intenta cambiar cierta característica del ratón, resulta sin embargo de gran interés cuando se quiere analizar la regulación de la expresión génica diferencial, porque el transgén podría expresarse en algunos tejidos y no en otros, o hacerlo sólo en algunos estados de desarrollo.

2- Introducción del transgén mediante virus. En algunos casos resulta más conveniente construir primero un virus que contenga el gen que se quiere incorporar al ratón, mediante técnicas que están bien definidas, y luego utilizar este virus(o retrovirus) como vehículo de infección. Resulta así que el transgén entra a la célula y luego al genoma del ratón de una manera natural, sin daño del embrión. Esta infección no es al azar sino que está precisamente definida: el DNA de un solo virus, conteniendo un transgén Unico, se insertará en un sitio predecible del genomio de la célula infectada.

El método consiste en incubar oocitos fecundados en un medio de cultivo que contenga partículas virales en solución. Sin embargo, a infección requiere un tiempo largo de exposición al virus, durante el cual el embrión alcanza a tener Varias células (nunca más de 30), y con frecuencia ocurre que no todas se infectan. El resultado es un individuo quimérico, es decir, sus células no tendrán la misma composición genética entre sí porque sólo algunas descenderán de células que adquirieron el transgén; no es posible asegurar que las células germinales lo adquieran y por lo tanto lo transmitan a la descendencia.

3- Células de teratocarcinoma portadoras del transgen. Los embriones de ratón, así como los de todos los mamíferos y de algunos otros animales también, son reguladores, es decir, son capaces de amortiguar cierto grado de perturbaciones, siempre que ocurran tempranamente, y continuar un desarrollo normal. Así por ejemplo, se puede dividir un embrión en dos o fusionar dos embriones en uno durante el desarrollo previo a la formación del blastocito y a su implantación en el endometrio; de los embriones divididos o fusionados resultarán ratones perfectamente viables normales en el primer caso y quiméricos en el segundo.

Otra propiedad sorprendente de los embriones de ratón es que son capaces de normalizar células tumorales cancerosas (teratocarcinomas). Si este tipo de células se agrega entre dos mórulas (embriones que tienen alrededor de ocho células) o se introduce en la cavidad de un blastocito, ellas son incorporadas al embrión, donde pierden frecuentemente sus características tumorales, normalizándose, y sus células hijas pueden encontrarse diferenciadas en los tejidos del cuerpo. No corresponde aquí analizar el significado de estas observaciones y sólo se mencionan porque sobre esta base se ha desarrollado un tercer método para obtener animales transgénicos. Consiste en introducir el gen en células de teratocarcinoma que se cultivan in vitro formando monocapas, ya sea microinyectando solución de DNA o infectando con virus para luego incorporar unas cuantas de estas células transgénicas en embriones preimplantacionales. Aunque el éxito de este método se ve disminuido, porque no siempre las células transgénicas se encuentran en la línea germinal, es en muchos casos el mejor porque ofrece la posibilidad de analizar la inserción del transgén y seleccionar las células tumorales transgénicas antes de agregarlas al embrión.

Cualquiera sea el método que se escoja, luego de la manipulación descrita el embrión debe ser devuelto a su medio natural en este caso el útero de una "madre portadora que ha sido preparada hormonalmente para tal propósito. (ver recuadro)

Si cada una de las etapas se realiza con éxito, se llegara a obtener un ratón transgénico en el 1% de los intentos, pero habrá que observar la descendencia para saber si se ha conseguido una línea transgénica.

En vertebrados que no son mamíferos las limitaciones para construir un animal transgénico son distintas. Por ejemplo, en aves es casi imposible obtener oocitos recién fecundados, por lo que la microinyección no puede realizarse y debe recurrirse exclusivamente a la infección con virus. En cambio, en anfibios y peces es posible microinyectar directamente en el citoplasma ya que sus enzimas de degradación parecen ser menos activas; además, como su desarrollo continua enteramente en un medio externo, transgenizar estos animales requiere menos acciones que en mamíferos.


Las aplicaciones

Desde el primer ratón transgénico, la técnica con todas sus variaciones se ha usado ampliamente y ya se han reportado cientos de casos construidos con objetivos muy diversos.

En animales transgénicos ha sido posible observar genes funcionando en condiciones naturales y se ha podido seguir su regulación temporal desde el embrión hasta el adulto, así como su regulación espacial, comparando los distintos tejidos. Y aunque el problema de la expresión génica diferencial aún constituya un misterio, lo es menos desde que se utiliza esta poderosa técnica. Los ratones transgénicos han permitido precisar la función de segmentos de DNA llamados promotores, que acompañan a los genes funcionales. Insertando un mismo gen pero asociado a distintos promotores, ha quedado demostrado que son éstos los que controlan la expresión de ese gen en un tejido especifico.

La embriología, por su parte, ha experimentado notables avances usando animales transgénicos; es así como se ha determinado cómo funcionan los genes que controlan el desarrollo embrionario de una mosca muy usada como modelo de investigación, la Drosophila. Se ha intentado lo mismo en el embrión de ratón, pero analizar el problema es más complejo porque no se conocen suficientemente los genes comprometidos en su desarrollo normal.

También en medicina los ratones transgénicos están transformándose en una herramienta fundamental. El ratón, que no era un buen modelo de biología y patología humana, comienza a ser el mejor. Un gran número de enfermedades congénitas a adquiridas son de origen genético a al menos, son favorecidas por la predisposición genética de ciertos individuos; por esto, no parecía un disparate, y de hecho no lo ha sido, reproducir enfermedades del hombre en el ratón insertándole los genes humanos que se estiman responsables. Por cierto que esto ha permitido poner a prueba distintos tratamientos en ratones transgénicos y extrapolar los resultados a la clínica humana. En cambio, parece aún muy limitada la "terapia génica", con la que se intentaría corregir anomalías provocadas por genes defectuosos insertando el gen normal, ya que no es posible dirigir la inserción al sitio correcto en el genoma ni tampoco remover el alelo defectuoso. Sin embargo, un transgen funcional podría suplir a un gen que esté inactivo al expresarse en cantidad suficiente, como se ha demostrado en la descendencia de una línea de ratones portadores de la enfermedad betatalasemia que es producida por deficiencia de la proteína betaglobina.

Por último, un campo que los animales transgénicos pueden revolucionar es la Biotecnología. Parece posible cambiar algunas características de los animales de valor económico, como ya se ha conseguido con los de experimentación, siempre que se resuelvan problemas operacionales como incrementar el bajo número de embriones que es posible manipular. Insertar el gen de la hormona de crecimiento, sin duda, resulta atractivo para los productores de ganado, de aves o de peces pero parece más atractivo aun cambiar ciertas características de esos animales, por ejemplo insertando genes de enzimas especificas que produzcan variaciones en la composición lipídica de la carne, o genes de la enzima que es factor limitante en la producción de la lana, o genes que confieran resistencia a las enfermedades que afectan la producción, o genes que hagan a los animales independientes de vitaminas exógenas, etc. Una aproximación diferente en Biotecnología es la de usar órganos de animales como fabricas productoras de proteínas; un caso espectacular resultó de adoptar un promotor especifico de expresión en glándula mamaria al gen de la proteína tPA (activador de plasminógeno) muy usada en el tratamiento de ciertas enfermedades. Cuando se insertó este transgen en un ratón se obtuvo una línea transgénica que producía la proteína tPA en la leche. Aunque todavía no sea una realidad tampoco es una especulación sin base pensar que se podría cambiar la composición de a leche que consumimos para hacerla más atractiva o más tolerable.

No puede dejar de mencionarse aquí, como seguramente ya habrán pensado los lectores, que los animales transgénicos proponen innumerables conflictos y riesgos de orden ético y ecológico, que podrían agravarse por la liberación deliberada o casual de estos animales al medio natural. Pero estos conflictos no sólo atañen a los investigadores sino que a toda la humanidad, porque si es objetable cambiar el patrimonio genético de un individuo, o transformar un Organo de un animal en secretor de una proteína útil, también lo seria alimentarse de animales modificados, como ya se hace, y que pronto incluso portarán genes humanos.

La ciencia experimental abunda en fantásticas promesas que no se cumplen, pero no es el caso de los animales transgénicos. Las extrañas perspectivas que nos abre no son ilusiones sino una visión en profundidad de la naturaleza viva que podría aclarar, quizás, la cuestión central del desarrollo humano: ¿cuánto es producto de la herencia y cuánto del ambiente?.



Roxana Pey

Departamento de Biología
Facultad de Ciencias, U. De Chile